Undecalcified العظام لإعداد الأنسجة ، وتحليل Histomorphometry ملون تألقي
Summary
Undecalcified الأنسجة العظام يوفر معلومات هامة لمجموعة متنوعة من التطبيقات السريرية والبحوث. فإنه يمثل تحديا تقنيا ، لا سيما مع عينات كبيرة الحجم. هذا الفيديو يوضح عملية إنتاج المقاطع ذات نوعية جيدة ويدل على الصعوبات التقنية والأساليب التي للتغلب عليها.
Abstract
Undecalcified الأنسجة العظمية يوضح الهيكل الصغير للعظم. ويعرض كل من المكونات المعدنية للعظم والخلوية ، التي توفر معلومات حيوية عن دوران العظم أو تكوين العظام وارتشاف. هذا له أهمية كبيرة في مجموعة متنوعة من التطبيقات السريرية والبحوث. أنها تعود الصور الجميلة (1) ويسمح لتقنيات مثل تقييم ملون تألقي وhistomorphometry 2. ملون تألقي التحليل هو تقنية حيث يتم حقن الأصباغ الفلورية التي تربط إلى الكالسيوم في نقطة زمنية معينة ، والذي يسمح لتقدير حجم كمية تمعدن في ذلك الوقت بعينه. Histomorphometry هو عملية تقدير العظام على المستوى المجهري.
أداء undecalcified الأنسجة العظمية يمثل تحديا تقنيا ، لا سيما مع عينات كبيرة الحجم. فهي تتطلب تغييرات في أسلوب من تلك المستخدمة في البارافين القياسية جزءا لا يتجزأ من الأنسجة. هذا الفيديو يوضح عملية إنتاج المقاطع ذات نوعية جيدة ويدل على الصعوبات التقنية والأساليب التي للتغلب عليها. وتتحقق إعداد العينات ، وتجهيز مع تثبيت بطريقة مماثلة لغيرها من الأنسجة اللينة ، ولكن نظرا لكثافة وأقل نفاذية للعظم كبير تعد مطلوبة تثبيت وتجهيز مرات ، مع الأخذ في كثير من الأحيان عدة أسابيع. ويتم تحقيق دمج باستخدام وسيلة دعم مماثل مع صلابة وكثافة أو يساوي حتى العظم مثل ميتاكريليت مقرها راتنجات ، ولكن خلافا تسلل البارافين والتضمين ، وهذا هو خطوة لا رجعة فيها. لا يمكن أن يتحقق عن طريق طحن Sectioning التي تنتج أكثر سمكا المقطع ، الذي هو الأمثل لمثل هذه الدراسات والتحليل ملون تألقي. هو أفضل طريقة لتحقيق ذلك باستخدام شفرة الماس على macrotome. بدلا من ذلك ، يمكن أن تنتج أرق أقسام للالمجهر الضوئي ويتحقق هذا باستخدام مشراح تمزلج بشفرة حادة جدا. ومشراح تمزلج يوفر قوة إضافية والاستقرار المطلوبة لكتل كبيرة وصعبة. يمكن أن تكون جزءا لا يتجزأ من المقاطع ملون الراتنج مع مجموعة متنوعة من البقع ، والتي أظهرت.
Protocol
Acknowledgements
فإن الكتاب أن نعترف بمساعدة السيدة سو كونيل لخبرتها في تضمين الراتنج ومقابر السيدة Stephania للخبرة مختبرها. فإن الكتاب أود أن أشكر الأستاذ الدكتور فرانك وKandziora Polboth ماري آن لنصائحهم.
Materials
- 10% Normal Buffered Formalin, Ethanol, Xylene and Butanol acid
All histology grade, sulfur free.
Grale Scientific Pty Ltd.
http://www.grale.com.au
- Peel away, plastic moulds
Grale Scientific
- SUPERFROST PLUS Microscope slides
Lomb Scientific Pty Ltd.
http://www.lomb.com.au
- GlycolMethacrylate Technovit 7100
Heraeus Kulzer
http://www.kulzer-technik.de/168/Products/Histology/Technovit_7100.htm - Backing Block Resin- Technovit 3040 Histo block
Heraeus Kulzer
(Reagents from Grale Scientific)
Goldner’s Trichrome stain
1. Weigert’s iron hemotoxylin (DeGroat)
| a) Hemotoxylin solution | |
| Hemotoxylin | 1g |
| Absolute Alcohol | 100mL |
| b) Iron Solution | |
| 30% aqueous ferric chloride | 4mL |
| Hydrochloric acid (concentrated) | 1mL |
| distilled Water | 95mL |
Filtered and added to equal volume of hemotoxylin immediately before stain used.
2. Ponceau-fuchsin-azophloxin stock solutions
| a) Ponceau de xylidine solution | |
| Ponceau de xylidine | 0.75g |
| acid fuchsion | 0.25g |
| Acetic Acid | 1mL |
| mix, and add distilled water (100mL) | |
| b) azophloxin solution | |
| Azophloxin | 0.5g |
| Acetic acid | 0.6mL |
| mix, and add distilled water (100mL) | |
| c) Final working stain solution | |
| Ponceau-fuchsin solution | 5-10mL |
| Azophloxin | 2mL |
| 0.2% acetic acid solution | 88mL |
3. Light Green Solution
| Light Green | 1g |
| acetic acid | 1mL |
| Mix, and add distilled water (500mL) | |
4. Phophomolybdic acid-Orange G solution
| Phosphomolybdic acid | 3g |
| Orange G | 2g |
| Dissolve in 500mL of distilled water and add crystal thymol. | |
Von Kossa Stain
| 1% aqueous silver nitrate |
| 2.5% sodium thiosulfate |
| 1% safranin O |
Alcian blue stain
| Alcian blue 8GX | 1g |
| 3% acetic acid solution | 100mL |
Hemotoxylin and Eosin stain
| a)Harris’s hemotoxylin | |
| Hemotoxylin | 2.5g |
| Absolute alcohol | 25mL |
| Potassium Alum | 50g |
| distilled water | 500mL |
| mercuric oxide | 1.25g OR |
| Sodium iodate | 0.5g |
| Glacial acetic acid | 20mL |
| b) Eosin solution | |
| Commercially produced Eosin was used. | |
All stain dye powders are Gurr dye powders.
All reagents are analytical reagents, and not Lab reagents
Fluorochromes
Manufacturer |
Fluorochrome | Catalogue Number |
| Sigma-Aldrich, Sydney | Calcein Green | C0875 |
| Sigma-Aldrich, Sydney | Alizarin Complexone | A3882 |
| Intervet Australia, Victoria | Oxytetracycline (off the shelf antimicrobial drug) |
Tradename; Engemycin 100 |
Riferimenti
- Kerr, J. . Atlas of Functional Histology. , 164-168 (2000).
- Parfitt, A. M. Bone histomorphometry: standardization of nomenclature, symbols, and units. Report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee. J Bone Miner Res. 2, 595-610 (1987).
- An, Y. H., Martin, K. l. . Handbook of histology methods for bone and cartilage. , (2003).
- Bancroft, J. D., Gamble, M. . Theory and Practice of Histological Techniques. , 352-360 (2008).
