الموصوفة هنا الإجراء ينفذ في الفريق غشاء Caffrey البيولوجيا البنيوية والوظيفية لإعداد يدويا المحاكمات بلورة البروتينات في الغشاء mesophases lipidic.
يوصف بروتوكول مفصلة لبلورة البروتينات الغشاء باستخدام mesophases lipidic. وقد تم هذا الأسلوب مختلفة يشار إلى المرحلة مكعب lipidic المتوسط أو في الأسلوب. وقد تبين أن الأسلوب تنوعا كبيرا في أنه قد تم استخدامه ليحل الأشعة السينية البلورات هياكل من البروتينات بروكاريوتيك وحقيقية النواة ، والبروتينات التي يتم موحودي ، وطي ، ومغاير multimeric ، حامل اللون التي تحتوي على حامل اللون والخطوط ، وألفا حلزونية ، وبروتينات بيتا للبرميل. النجاحات الأخيرة في بلورة باستخدام المتوسط هي الإنسان المهندسة beta2 – الأدرينالية ومستقبلات الأدينوساين A2A G البروتين يقترن. وتعرض بروتوكولات لإعادة تشكيل البروتين في غشاء mesophase monoolein مقرها ، وإنشاء التبلور في الوضع اليدوي. خطوات إضافية في العملية الشاملة ، مثل جمع الكريستال ، والتي ينبغي معالجتها في المقالات الفيديو المستقبل. الوقت اللازم لإعداد mesophase البروتين تحميل وإعداد لوحة التبلور هو يدويا حوالي ساعة واحدة.
المرحلة مكعب هي بيئة حساسة وحيوية يمكن أن تغير جذريا مع تغيير عدد من المتغيرات. ليس من الممكن أن يقدم وصفا من الإعداد للمحاكمات في المتوسط في بلورة الوضع اليدوي الذي يصف كل المزالق المحتملة. ومع ذلك ، يمكن تجنب العديد من الصعوبات من خلال ممارسة هذا الأسلوب قبل تطبيقه إلى حلول مكلفة والبروتين باستخدام الاعتدال في الضغوط التي مورست على الحقن خلال عملية الخلط. عمله بشكل صحيح ، في أسلوب المتوسط يمكن أن تسفر عن بلورات من طائفة واسعة من البروتينات ، وعدد الذي يتزايد باستمرار.
وتركز على الوصف الوارد هنا من الإعداد للمحاكمات في التبلور المتوسط على الوضع اليدوي. يمكن أن تكون العملية ، وغالبا ما يتم تعديل لتسهيل الإعداد الآلي لوحات تبلور في تلك الحالات التي تتطلب الفحص واسعة النطاق للظروف التبلور.
هناك العديد من الذين ساهموا في هذا العمل ، ومعظمهم من الغشاء Caffrey الهيكلية والوظيفية مجموعة البيولوجيا ، وهما عضوان في الماضي والحاضر. لجميع نتقدم بأحر الشكر والتقدير. وأيد هذا العمل في جزء من المنح المقدمة من مؤسسة العلوم ايرلندا (07/IN.1/B1836) ، والمعاهد الوطنية للصحة (GM75915) ، وجامعة ليميريك.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Protein solution | Reagent | Various | Various | |
Lipid (monoolein) | Reagent | Sigma/NuCheck | Various | |
Precipitant solutions | Reagent | Various | Various | |
Purified water | Reagent | Millipore | ||
Pipetting devices | Tool | Pipetman | Various | |
Disposable pipet tips | Disposable | Pipetman | Various | |
Gas-tight syringes | Tool | Hamilton | 80265 (25-μl) | |
Syringe tips | Tool | Hamilton | 7770-020 (gauge 22) | |
Narrow bore coupler* | Tool | Hamilton/Emerald | various/EBS-LCP-2 | |
Repeating dispenser | Tool | Hamilton | 83700 | |
Silanized glass microscope slides | Disposable | GoldSeal | 3010 | |
microscope coverslips | Disposable | Fisher Scientific | 12-548C | |
Perforated double-stick spacer tape | Disposable | Saunders Corporation (hole-punched) | NA | |
Tweezers | Tool | Various | NA | |
Brayer (roller) | Tool | Fisher Scientific | 50820937 | |
Chipped ice | Temperature Control | NA | NA | |
Tissues | Disposable | NA | NA | |
Calculator | Tool | Various | NA | |
Lab notebook | Tool | Various | NA |
* Full details for machining your own Narrow Bore Coupler are provided in Reference 3.