アダルトゼブラフィッシュからの臓器の解剖

Summary

このプロトコルは、成人のゼブラフィッシュから臓器を特定し、解剖するための手順を説明します。

Abstract

過去20年間で、ゼブラフィッシュは、脊椎動物の発生や疾患を理解するための強力なモデル生物となっています。胚および幼虫の実験的分析は広範であり、形態が十分に文書化されているが、一緒に大人と一緒に作業するためのテクニックを持つ成人のゼブラフィッシュの解剖学と成人の構造や臓器の開発の研究の説明は、不足している。幼虫の臓器は、その全体的な構造、形態、及び成人への移行幼虫の時の解剖学的位置に大きな変化を受ける。内部的に、臓器が巨大な成長とリモデリングを受ける間、外部から、透明な幼虫は、その特徴的な大人のストライプpigmentパターンと対になった骨盤のフィンを開発しています。さらに、両性能の生殖腺の原基が精巣か卵巣のどちらかに開発しています。このプロトコルは、成体の器官の多くを識別し、脳、生殖腺、消化器系、心臓、および成人のゼブラフィッシュの腎臓の解剖のための方法を示しています。解剖の臓器は、in situハイブリダイゼーション、免疫組織化学、組織学、RNAの抽出、タンパク質解析、および他の分子技術のために使用することができます。このプロトコルは、幼虫の臓器のリモデリング、成体の器官系の成人およびその他の調査への特定の器官の形態形成を含むようにゼブラフィッシュでの研究の広がりを支援します。

Protocol

男性のゼブラフィッシュは、メスの魚の順で解剖されます。解剖を始める前に、0.2％Tricaineで魚を麻酔し、15分間氷水中でインキュベーションすることで安楽死させる。 軽くペーパータオル上で乾燥した魚を叩くと、解剖用マットの上に置くことによって始めます。外部から、ゼブラフィッシュは、単一の背、尾と鰭と対になった胸と骨盤のフィン（図1）を持ちます。 図1ラベル付きのフィンを持つ成人男性の魚。 尾の肉厚部を介して解剖用マットに魚と眼窩の腹側部分を固定。 しりびれのちょうど前の魚の腹の皮膚をスニップ。しりびれから蓋に腹（ギル以上ハードカバー）（図2、ステップ1）に沿って皮膚と基礎となる筋肉をカット。 図2皮膚や内臓を公開するために体壁筋を取り除くのステップ。 次に、胸帯（フィンの基部の厚さ、骨の多い地域）（図2、ステップ2）を含めて、蓋と胸びれを取り外します。ダウン尻鰭（図2、ステップ3）にして魚の側面に沿って、現在露出鰓後方の上から始まり、皮膚の基礎となる筋肉をカット。 慎重に魚の側面から皮膚や基礎となる筋肉を取り除く。内臓の多くは、現在（図3）表示されます。 図3。体壁と筋肉を持つ成人男性の魚は内臓の可視化を可能に削除。 精巣は、背側体壁に接続されている長い、白、対になった器官である。精巣を削除し、PBSの皿に入れてください。 spermatagoniaから精子への発展途上の生殖細胞のさまざまな段階（レアルら、2009）で嚢胞を含む精細管（図4）、可視化するために反射光で精巣を調べます。 図4精巣の解剖。白い丸みを帯びた構造は精細管です。 次に、魚の体腔から胃腸系を削除します。肝臓はその大きさ、ローブ形態、黄褐色がかった色、そして豊富な血管新生によって識別することができます。明るい赤を表示される胆嚢、緑色の半透明の液体で満たされた嚢、および脾臓は、内臓の中にあります。 臓器の残りの部分から腸を分離し、それを差し伸べる。腸の前方、中間、および後部領域は上皮ひだの高さ（Wallaceら、2005）によって定義されています。 PBSで腸の一部を配置し、透過光を用いて上皮ひだを観察。 次に、浮き袋を調べます。浮き袋は、ウェーバーの装置（フィニーら、2006）を介して内耳に接続されている空気圧ダクト、および前房、を経由して食道に接続されている後房、から構成されています。 浮き袋を取り外して廃棄。魚の固定を解除し、再度ピンに腹側を上に背側体壁に沿って配置されている腎臓を、分析する。腎臓は背側大動脈と色素細胞に関連付けられている半透明のピンクの構造体です。腎臓は、頭部、ボディ、および尾部の領域（図5）に分かれています。腎臓の一部を摘出し、PBSに入れてください。腎尿細管を明らかにするために腎臓の組織を離れていじめる。 図5。頭部、ボディ、および背側体壁に沿って尾の腎臓の位置。 メスの魚を解剖。前述のように、氷水で魚を安楽死させると解剖マットにそれを固定する前に乾燥したそれをなでる。以前に示したように魚の側面から皮膚を取り除きます。卵巣は、血管形成の卵巣間膜によって体腔に一時停止されているbilobed構造です。 卵巣の一葉を除去、PBSに入れ、透過光でそれを調べる。卵母細胞は微細な針を使用して離れてからかったし、（図6、セルマンら、1993）ステージングできます。 I期の卵母細胞は約10です – 大きさと半透明の150ミクロン。大きさは350ミクロンと皮質顆粒の出現によって定義 – II期の卵母細胞は、約150です。 III期の卵母細胞は350です – 大きさで750ミクロンと卵黄の蓄積による不透明です。成熟期IVおよびVの卵母細胞は半透明であり、一般に最近交配した雌の​​卵巣には見られない。 図6。ライブステージI、II、およびIIIの卵母細胞は下に観察さ透過光で顕微鏡を解剖。 次に、魚から心臓を解剖。心臓は後部と鰓に腹側に位置しています。心と周囲の組織のすべてを切断し、PBSに置くことで始める。慎重に繊細なアトリウムを傷つけないように注意しながら、心臓周辺の組織を離れて分析する。 ハートビートを監視するためにリンゲル液中に切除した心臓を置きます。 心房、心室、および動脈球（図7、Huら、2001）を特定します。 図7。成人心臓を解剖。 魚から脳を削除して解剖を完了します。魚を固定解除し、かみそりの刃で頭を最初に取り外します。鉗子で頭蓋骨の腹側から可能な限り多くの軟組織のように取り外します。小さな春のはさみを使って目を削除します。頭蓋骨を開き、脳の腹側から骨を除去破る。今PBSの皿に頭を置いて、脳の背側から皮膚と頭蓋骨の骨を取り除く。 嗅球、終脳、手綱、視蓋、小脳および延髄（。。シリング、2002図8、Wullimannら、1996）を特定します。 図8。ディテールに秘められた大人のゼブラフィッシュの脳。トップへ前背ビュー、。

Materials

Reagents:

0.2% Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate)
200 mg tricaine powder
97.9 ml DD water
~1 ml 1 M Tris (pH 9)
Adjust pH to 7.0

Phosphate buffered saline (PBS)
4.0 g NaCl
0.1 g KCl
100 ml 0.1 M PO₄ Buffer, pH 7.3
150 ml dH₂O

Ringer’s solution
6.7g NaCl
0.2g KCl
0.2g CaCl₂
1.2g Hepes
1 L H₂O
Adjust pH to 7.2

Equipment:

Dissecting dish with mat
Electron Microscopy Sciences
catalog #70540

Vannas spring scissors
Fine Science Tools
catalog #91500-09