يعيش التصوير في القدرة على الحركة والهيكل الخلوي أكتين خلية من الخلايا العصبية الفردية والخلايا العصبية في الأجنة كريست اسماك الزرد
Summary
يصف هذا البروتوكول التصوير من الخلايا العصبية الفردية أو الخلايا العصبية في قمة العيش الأجنة الزرد. ويستخدم هذا الأسلوب لدراسة سلوكيات الخلوية والتوطين أكتين باستخدام مضان مبائر الوقت الفاصل بين المجهري.
Abstract
والزرد هو النموذج المثالي للسلوك الخلية التصوير خلال التنمية في الجسم الحي. والأجنة المخصبة الزرد خارجيا ، وبالتالي يسهل الوصول إليها في جميع مراحل التنمية. علاوة على ذلك ، درجة وضوحها البصرية يسمح ارتفاع القرار التصوير من الخلايا والديناميات الجزيئية في البيئة الطبيعية للجنين سليمة. نحن باستخدام نهج التصوير العيش لتحليل سلوك الخلية العصبية خلال قمة الهجرة الخليوي ، وثمرة لتوجيهات ومحاور الخلايا العصبية.
يعيش التصوير مفيد بشكل خاص لفهم الآليات التي تنظم عمليات حركية الخلية. لتصور تفاصيل خلية حركية ، مثل النشاط تبارزي والديناميات الجزيئية ، فإنه من المفيد تسمية الخلايا الفردية. في الزرد ، البلازميد حقن الحمض النووي تعطي التعبير الفسيفساء عابرة نمط ويقدم فوائد متميزة عن غيرها من أساليب وسم الخلية. على سبيل المثال ، خطوط المعدلة وراثيا في كثير من الأحيان تسمية السكان الخلية بأكملها ، وبالتالي قد تحجب رؤية من نتوءات غرامة (أو تغييرات في توزيع الجزيئية) في خلية واحدة. بالإضافة إلى ذلك ، حقن الحمض النووي في مرحلة واحدة الخلية هو أقل الغازية وأكثر دقة من حقن صبغة في مراحل لاحقة.
نحن هنا تصف طريقة لوضع العلامات الفردية الخلايا العصبية أو خلايا النامية قمة العصبية والتصوير سلوكهم في الجسم الحي. نحن حقن الحمض النووي بلازميد في خلايا أجنة 1 المرحلة ، والذي ينتج التعبير التحوير الفسيفساء. ناقلات تحتوي على خلايا معينة المروجين هذا التعبير محرك الجين من الاهتمام في مجموعة فرعية من الخلايا العصبية الحسية أو الخلايا العصبية العرف. نحن نقدم أمثلة من الخلايا المسمى مع GFP غشاء المستهدفة أو مع التحقيق الذي تجريه جهاز الاستشعار البيولوجي التي تسمح برؤية أكتين F – 1 في الخلايا الحية.
ساهم إيريكا أندرسون ، Asuri نامراتا ، وماثيو كلاي على قدم المساواة في هذا العمل.
Protocol
Discussion
وسوف تركز الأمثل لحقن الحمض النووي تختلف تبعا لحجم وقوة بناء المروج وينبغي أن تحدد تجريبيا. ويمكن حقن الحمض النووي يؤدي إلى الكثير من الأجنة غير صحية واسعة النطاق مع موت الخلايا ، في حين أن القليل جدا سوف يؤدي إلى نسبة ضئيلة جدا من الأجنة حقن معربا عن التحوير. مستوى ال…
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة R01 تم الحصول NS042228 لصحة الأم والطفل ومبائر FV1000 أوليمبوس مع الأجهزة المشتركة المعاهد الوطنية للصحة منح S10RR023717 إلى قسم علم الحيوان UW (PI بيل Bement).
ساهم إيريكا أندرسون ، Asuri نامراتا ، وماثيو كلاي بالتساوي على هذه الورقة.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma | A5040-250G | ||
| Sylgard Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | 184 | ||
| QIAfilter Plasmid Midi Kit | Qiagen Inc. | 12243 | ||
| Low melting point agarose | Invitrogen | 15517-014 | ||
| Picospritzer | Parker Instrumentation, General Valve Division | 051-0302-900 |
Riferimenti
- Burkel, B. M., von Dassow, G., Bement, W. M. Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin. Cell motility and the cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).
- Blader, P., Plessy, C., Strahle, U. Multiple regulatory elements with spatially and temporally distinct activities control neurogenin1 expression in primary neurons of the zebrafish embryo. Mech Dev. 120, 211-218 (2003).
- Wada, N., Javidan, Y., Nelson, S., Carney, T. J., Kelsh, R. N., Schilling, T. F. Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull. Development. 132, 3977-3988 (2005).
- Cheo, D. L., Titus, S. A., Byrd, D. R., Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. Concerted assembly and cloning of multiple DNA segments using in vitro site-specific recombination: functional analysis of multi-segment expression clones. Genome Res. 14, 2111-2120 (2004).
- Kwan, K. M., Fujimoto, E., Grabher, C., Mangum, B. D., Hardy, M. E., Campbell, D. S., Parant, J. M., Yost, H. J., Kanki, J. P., Chien, C. B. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev Dyn. 236, 3088-3099 (2007).
- O’Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J Vis Exp. 24, (2009).
- Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo. Dev Biol. 324, 236-244 (2008).
