Live-Imaging von Zellbewegung und Aktin-Zytoskelett von einzelnen Neuronen und Zellen der Neuralleiste in Zebrafisch-Embryos
Summary
Dieses Protokoll beschreibt Abbildung von einzelnen Neuronen oder Neuralleistenzellen in lebenden Zebrafisch-Embryonen. Diese Methode wird verwendet, um zelluläre Verhaltensweisen und Aktin-Lokalisierung mittels Fluoreszenz konfokalen Zeitraffer-Mikroskopie zu untersuchen.
Abstract
Der Zebrafisch ist ein ideales Modell für die Bildgebung Zelle Verhaltensweisen während der Entwicklung in vivo. Zebrafisch-Embryos werden extern befruchtet und damit leicht zugänglich in allen Phasen der Entwicklung. Darüber hinaus ermöglicht die optische Klarheit hochauflösende Bildgebung von Zell-und molekulare Dynamik in die natürliche Umgebung des intakten Embryo. Wir sind mit einem Live-Imaging-Ansatz zur Zelle Verhalten während Neuralleiste Zellmigration und das Auswachsen und Führung des neuronalen Axonen zu analysieren.
Live-Bildgebung ist besonders hilfreich für das Verständnis der Mechanismen, die Zellbewegung Prozesse regulieren. Zur Visualisierung Details der Zellbewegung, wie protrusive Aktivität und Molekulardynamik, ist es vorteilhaft, einzelne Zellen markieren. In Zebrafisch, ergibt Plasmid-DNA Injektion eine vorübergehende Mosaik Expressionsmuster und bietet deutliche Vorteile gegenüber anderen Zellmarkierung Methoden. Zum Beispiel, transgenen Linien oft label gesamten Zellpopulationen und damit kann die Visualisierung der feinen Vorsprünge (oder Veränderungen in der molekularen Verteilung) in einer einzelnen Zelle im Dunkeln. Darüber hinaus ist die Injektion von DNA in der Ein-Zell-Stadium weniger invasiv und präziser als Farbstoff Injektionen in späteren Phasen.
Hier beschreiben wir eine Methode zur Kennzeichnung von einzelnen Entwicklungsländern Neuronen oder Neuralleistenzellen und Imaging ihr Verhalten in vivo. Wir injizieren Plasmid-DNA in 1-Zell-Stadium Embryonen, die in Mosaik Transgenexpression Ergebnisse. Die Vektoren enthalten Zell-spezifische Promotoren, fahren die Expression eines Gens von Interesse in einer Untergruppe von sensorischen Neuronen oder Neuralleistenzellen. Wir geben Beispiele von Zellen mit Membran gezielt GFP oder mit einem Biosensor-Sonde, die Visualisierung von F-Aktin ermöglicht in lebenden Zellen mit 1 bezeichnet.
Erica Andersen, Namrata Asuri und Matthew Lehm trugen gleichermaßen zu dieser Arbeit.
Protocol
Discussion
Die optimale Konzentration der injizierten DNA variiert je nach Größe und Stärke der Promotor-Konstrukt und sollten empirisch ermittelt werden. Die Injektion von zu viel DNA kann zu ungesunden Embryonen mit umfangreichen Zelltod führen, während zu wenig in einem sehr kleinen Teil der injizierten Embryonen exprimieren das Transgen führen wird. Die DNA-Expression korreliert mit der Stärke des Fluorophor-Signal, das von Zelle zu Zelle variiert. Während Sortierung Embryonen unter Epifluoreszenz, schließen diejenige…
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom NIH R01 unterstützt NS042228 zu MCH Die Olympus FV1000 konfokalen mit einem NIH gemeinsame Instrumente zu gewähren S10RR023717 der UW Zoologisches Institut (PI Bill Bement) erworben wurde.
Erica Andersen, Namrata Asuri und Matthew Lehm trugen gleichermaßen zu dieser Veröffentlichung.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma | A5040-250G | ||
| Sylgard Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | 184 | ||
| QIAfilter Plasmid Midi Kit | Qiagen Inc. | 12243 | ||
| Low melting point agarose | Invitrogen | 15517-014 | ||
| Picospritzer | Parker Instrumentation, General Valve Division | 051-0302-900 |
Riferimenti
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