Imagens ao vivo da motilidade celular e citoesqueleto de actina de neurônios individuais e células da crista neural em embriões Zebrafish
Summary
Este protocolo descreve imagens de neurônios individuais ou de células da crista neural em embriões vivos zebrafish. Este método é usado para examinar comportamentos e localização celular actina microscopia de fluorescência usando lapso de tempo confocal.
Abstract
O peixe-zebra é um modelo ideal para comportamentos imagens de células durante o desenvolvimento in vivo. Embriões fertilizados peixe-zebra são externamente e, portanto, facilmente acessível em todas as fases de desenvolvimento. Além disso, sua claridade óptica permite imagens de alta resolução de celular e dinâmica molecular no ambiente natural do embrião intacto. Estamos usando uma abordagem imagens ao vivo para analisar comportamentos durante a migração de células da crista neural celular e no crescimento e orientação dos axônios dos neurônios.
Imagens ao vivo é particularmente útil para a compreensão dos mecanismos que regulam os processos de motilidade celular. Para visualizar detalhes da motilidade celular, como a atividade protrusiva e dinâmica molecular, é vantajoso para rotular células individuais. Em peixes-zebra, a injeção de DNA plasmídeo produz um padrão de expressão transitória mosaico e oferece benefícios distintos sobre os métodos de rotulagem outras células. Por exemplo, linhagens transgênicas muitas vezes rótulo populações de células inteiras e, portanto, pode obscurecer a visualização das saliências finas (ou mudanças na distribuição molecular) em uma única célula. Além disso, a injeção de DNA na fase unicelular é menos invasivo e mais preciso do que injeções de corante em fases posteriores.
Aqui nós descrevemos um método para a rotulagem de neurônios individuais em desenvolvimento ou células da crista neural e imagem o seu comportamento in vivo. Nós injetar DNA plasmídeo em uma célula de embriões palco, o que resulta em expressão do transgene mosaico. Os vetores contêm células específicas promotores que a expressão da unidade de um gene de interesse em um subconjunto de neurônios sensoriais ou células da crista neural. Nós fornecemos exemplos de células marcadas com GFP membrana alvo ou com uma sonda biosensor que permite a visualização de F-actina em células vivas 1.
Erica Andersen, Namrata Asuri e Mateus Barro contribuíram igualmente para este trabalho.
Protocol
Discussion
A concentração ótima de DNA injetado irá variar dependendo do tamanho e da força do promotor construir e deve ser determinada empiricamente. Injeção de DNA em excesso pode levar a embriões doentia com a morte celular extensa, enquanto que muito pouco irá resultar em uma proporção muito pequena de embriões injetados expressando o transgene. O nível de expressão de DNA se correlaciona com a força do sinal fluoróforo, que varia de célula para célula. Embora a triagem de embriões sob epifluorescência, ex…
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo NIH R01 NS042228 para MCH O FV1000 Olympus confocal foi adquirido com uma instrumentação compartilhada NIH conceder S10RR023717 ao Departamento de Zoologia UW (PI Bement Bill).
Erica Andersen, Namrata Asuri e Mateus Barro contribuíram igualmente para este papel.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma | A5040-250G | ||
| Sylgard Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | 184 | ||
| QIAfilter Plasmid Midi Kit | Qiagen Inc. | 12243 | ||
| Low melting point agarose | Invitrogen | 15517-014 | ||
| Picospritzer | Parker Instrumentation, General Valve Division | 051-0302-900 |
Riferimenti
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