Этот протокол описывает изображения отдельных нейронов или нервных клеток гребня в живых рыбок данио эмбрионов. Этот метод используется для изучения поведения и сотовой локализации актина с помощью флуоресцентной конфокальной покадровой микроскопии.
Данио является идеальной моделью для работы с изображениями камера поведения в процессе развития в естественных условиях. Данио рерио эмбрионы внешне оплодотворенной и, следовательно, легко доступны на всех этапах развития. Более того, их оптическая прозрачность позволяет высоким разрешением клеточной и молекулярной динамики природной среды нетронутыми эмбриона. Мы используем подход жить изображений для анализа поведения ячейки во время нейронные миграции клеток гребня и результатом и руководства нейронных аксонов.
Живая изображения особенно полезна для понимания механизмов, регулирующих процессы клеточной подвижности. Чтобы представить себе детали клеточной подвижности, таких как выступающими деятельности и молекулярная динамика, это выгодно для обозначения отдельных ячеек. В данио рерио, ДНК плазмиды инъекция дает переходный характер экспрессии мозаики и предлагает явные преимущества перед другими методами маркировки клеток. Например, трансгенные линии часто этикетке всей популяции клеток и таким образом может заслонить визуализации тонких выступов (или изменений в молекулярно-массовое распределение) в одну ячейку. Кроме того, введение ДНК в один-клеточной стадии менее инвазивных и более точных, чем краситель инъекции на более поздних этапах.
Здесь мы опишем метод маркировки отдельных развивающихся нейронов или нервных клеток гребня и визуализации их поведение в естественных условиях. Мы вводят плазмиды ДНК в 1-клеточной стадии эмбриона, в результате чего мозаика выражение трансгена. Векторы содержат ячейки конкретных промоутеров, которые управляют выражение гена в подмножество сенсорных нейронов или нервных клеток гребня. Мы предоставляем примеры клетки помечены мембраны целевых GFP или биосенсор зонд, который позволяет визуализировать F-актина в живых клетках 1.
Эрика Андерсена, Namrata Asuri, и Мэтью Клей способствовали в равной степени к этой работе.
Оптимальная концентрация вводили ДНК будет варьироваться в зависимости от размера и силы промоутер строительства и должен быть определен эмпирически. Инъекция слишком много ДНК может привести к нездоровым эмбрионов с обширной гибель клеток, в то время слишком мало приведет к очень н?…
Эта работа была поддержана NIH R01 NS042228 к MCH Olympus FV1000 конфокальной была приобретена с приборами NIH общие грант S10RR023717 к UW кафедре зоологии (П. И. Билл Бемент).
Эрика Андерсена, Namrata Asuri, и Мэтью Клей способствовали в равной степени к этой статье.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma | A5040-250G | ||
Sylgard Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | 184 | ||
QIAfilter Plasmid Midi Kit | Qiagen Inc. | 12243 | ||
Low melting point agarose | Invitrogen | 15517-014 | ||
Picospritzer | Parker Instrumentation, General Valve Division | 051-0302-900 |