Bildproduktion för cell motilitet och Actin cytoskelettet av enskilda nervceller och neurala celler Crest i Zebrafish embryon
Summary
Detta protokoll beskriver avbildning av enskilda nervceller eller neurala celler crest i levande zebrafisk embryon. Denna metod används för att undersöka cellulära beteenden och aktin lokalisering med hjälp av fluorescens konfokala time-lapse mikroskopi.
Abstract
Den zebrafisk är en idealisk modell för beteenden avbildning celler under utvecklingen in vivo. Zebrafisk embryon externt befruktas och därmed lättillgänglig på alla stadier av utveckling. Dessutom tillåter deras optiska klarhet högupplösande avbildning av cell-och molekylär dynamik i den naturliga miljön för den intakta embryot. Vi använder ett levande avbildningsteknik att analysera celler beteenden under neural crest cell migration och utväxt och vägledning av neuronala axoner.
Bildproduktion är särskilt användbart för att förstå mekanismerna som reglerar processer cell motilitet. För att visualisera information om cell motilitet, såsom UTSTÅENDE aktivitet och molekylär dynamik, är det fördelaktigt att märka enskilda celler. I zebrafisk, ger plasmid DNA-injektion en övergående mönster mosaik uttryck och ger tydliga fördelar jämfört med andra metoder cell märkning. Till exempel transgena linjerna etikett oftast hela cellpopulationer och därmed kan dölja visualisering av böter utbuktningar (eller förändringar i molekylär distribution) i en enda cell. Dessutom är injektion av DNA i en cell steg mindre invasiv och mer exakt än dye injektioner i senare skeden.
Här beskriver vi en metod för märkning av enskilda utvecklingsländer nervceller eller neurala celler crest och bildhantering deras beteende in vivo. Vi injicera plasmid DNA i 1-cell embryon skede, vilket resulterar i mosaik transgenen uttryck. Vektorerna innehåller cell-specifika projektansvariga som driver uttrycket av en gen intresse för en delmängd av sensoriska neuroner och neurala celler krön. Vi ger exempel på celler märkta med membran riktade GFP eller med en biosensor sond som tillåter visualisering av F-aktin i levande celler 1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, och Matthew Clay bidragit lika för detta arbete.
Protocol
Discussion
Den optimala koncentrationen av tillförd arvsmassa varierar beroende på storlek och styrka initiativtagaren konstruera och bör bestämmas empiriskt. Injektion av för mycket DNA kan leda till ohälsosamma embryon med omfattande celldöd, medan för lite kommer att resultera i en mycket liten del av injicerade embryon uttrycka transgenen. DNA-uttrycket nivån korrelerar med styrka fluoroforen signalen, som varierar från cell till cell. Även om sorteringen embryon i epifluorescence utesluta de med extremt höga nivå…
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av NIH R01 NS042228 till MCH Olympus FV1000 konfokala förvärvades med en NIH gemensamt instrumentering bevilja S10RR023717 till UW Zoologiska institutionen (PI Bill Bement).
Erica Andersen, Namrata Asuri, och Matthew Clay bidragit lika för detta dokument.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma | A5040-250G | ||
| Sylgard Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | 184 | ||
| QIAfilter Plasmid Midi Kit | Qiagen Inc. | 12243 | ||
| Low melting point agarose | Invitrogen | 15517-014 | ||
| Picospritzer | Parker Instrumentation, General Valve Division | 051-0302-900 |
Riferimenti
- Burkel, B. M., von Dassow, G., Bement, W. M. Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin. Cell motility and the cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).
- Blader, P., Plessy, C., Strahle, U. Multiple regulatory elements with spatially and temporally distinct activities control neurogenin1 expression in primary neurons of the zebrafish embryo. Mech Dev. 120, 211-218 (2003).
- Wada, N., Javidan, Y., Nelson, S., Carney, T. J., Kelsh, R. N., Schilling, T. F. Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull. Development. 132, 3977-3988 (2005).
- Cheo, D. L., Titus, S. A., Byrd, D. R., Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. Concerted assembly and cloning of multiple DNA segments using in vitro site-specific recombination: functional analysis of multi-segment expression clones. Genome Res. 14, 2111-2120 (2004).
- Kwan, K. M., Fujimoto, E., Grabher, C., Mangum, B. D., Hardy, M. E., Campbell, D. S., Parant, J. M., Yost, H. J., Kanki, J. P., Chien, C. B. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev Dyn. 236, 3088-3099 (2007).
- O’Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J Vis Exp. 24, (2009).
- Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo. Dev Biol. 324, 236-244 (2008).
