الفئران نموذج تفعيل CD40 - B من الخلايا
Summary
في هذا الفيديو ، ونحن لشرح اجراءات التنشيط CD40 ، والتوسع في خلايا الفئران B من splenocytes من C57BL / 6 الفئران ، والتي يمكن استخدامها بوصفها خلية مستضد تقديم نموذج (APC) لدراسة تحريض الحصانة.
Abstract
وقد أظهرت البحوث على الخلايا البائية أن التنشيط CD40 يحسن قدرتها على تقديم المستضد. عندما حفز مع وانترلوكين 4 – CD40 يجند (CD40L) ، يمكن توسيع خلايا B الإنسان دون صعوبات من كميات صغيرة من الدم المحيطي في غضون 14 يوما لكميات كبيرة جدا من خلايا CD40 – B نقية عالية (> 10<sup> 9</sup> خلايا لكل مريض) من المتبرعين الأصحاء فضلا عن مرضى السرطان<sup> 1-4</sup>. CD40 – B المهم التعبير عن جزيئات الخلايا اللمفاوية صاروخ موجه ، ويمكن أن تجذب الخلايا التائية<em> في المختبر</em<sup> 5</sup>. وعلاوة على ذلك أنها تأخذ بكفاءة أعلى ، والعملية الحالية لمستضدات الخلايا التائية<sup> 6،7</sup>. عرضت CD40 – B الخلايا ليست فقط ساذجة الوزراء ، وإنما أيضا توسيع الخلايا التائية الذاكرة<sup> 8،9</sup>. ولذلك قد درست CD40 تنشيط خلايا B (CD40 – B الخلايا) كمصدر بديل للالمناعية تنشيطية مستضد تقديم الخلايا (APC) لخلية مقرها immunotherapy1 ، 5،10. من أجل مزيد من الدراسة ما إذا كانت الخلايا CD40 – B تحفز الاستجابات فعالية الخلايا التائية في الجسم الحي ، ودراسة الآلية الكامنة أنشأنا نظاما ثقافة الخلية لتوليد خلايا الفئران B – CD40 تفعيلها. كانوا يستخدمون splenocytes أو تنقيتها من خلايا الفئران C57BL B / 6 ، لتفعيل CD40 ، حددت الظروف المثلى على النحو التالي : يتم تنقيتها ابتداء من splenocytes من C57BL / 6 الفئران (النمط الفرداني H – 2B) الخلايا الليمفاوية بواسطة الطرد المركزي المتدرج الكثافة وشارك في تربيتها مع هيلا خلايا الفئران معربا عن المؤتلف CD40 يجند (tmuCD40L هيلا)<sup> 11</sup>. هي خلايا recultured كل 3-4 أيام والمكونات الرئيسية مثل CD40L ، انترلوكين 4 – المركابتويثانول ويتم تجديد السيكلوسبورين A. في هذا البروتوكول ونحن لشرح كيفية الحصول على تفعيلها بشكل كامل الفئران CD40 – B الخلايا (mCD40B) مع APC – مماثل النمط الظاهري لخلايا CD40 – B الإنسان (الشكل 1A ، ب). CD40 – يؤدي إلى تحفيز نمو السريع والتوسع في نقية للغاية (> 90 ٪) CD19 خلايا B + في غضون 14 يوما من زراعة الخلايا (الشكل 1C ، د). لتجنب التلوث مع المنظمات غير transfected الخلايا ، والتعبير ليجند CD40 الفئران على transfectants يجب أن يكون للرقابة بشكل منتظم (الشكل 2). ويمكن استخدام الفئران CD40 تنشيط خلايا B لدراسة الخلية B – التنشيط والتمايز ، وكذلك للتحقيق إمكاناتها لتؤدي وظيفة APC في المختبر والمجراة. وعلاوة على ذلك ، لأنها تمثل أداة واعدة لإقامة التطعيم علاجية أو وقائية ضد الأورام وسوف تساعد على الإجابة عن الأسئلة المتعلقة بالسلامة واستمناع هذا النهج<sup> 12</sup>.
Protocol
Discussion
إدخال تعديلات على هذا البروتوكول أمر ممكن ، وخصوصا فيما يتعلق أصل التحفيز CD40 ونوع السلالة الماوس المستخدمة ، مما أسفر أيضا في توليد خلايا الفئران كفاءة B – CD40 تفعيلها. الأحمدي وآخرون. وقد أظهرت نتائج مماثلة بالنسبة لالليفية الماوس transfected مع الفئران CD40 – يجند. ويمكن في ه…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور كليمنس تتكرم Wendtner لتوفير tmuCD40 – يجند الحله خط الخلية.
Materials
A. Preparation of Media:
| Feeder cell wild type medium | Feeder cell selection medium | ||
| Reagent | Concentration | Reagent | Concentration |
| RPMI 1640 | RPMI 1640 | ||
| L-Glutamine | 300 μg/mL | L-Glutamine | 300 μg/mL |
| FBS | 10 % | FBS | 10 % |
| HEPES | 10 mM | HEPES | 10 mM |
| Gentamycin | 15 μg/mL | Gentamycin | 15 μg/mL |
| Hygromycin B | 0.2 mg/mL |
| mCD40-B washing medium | mCD40-B culture medium | ||
| Reagent | Concentration | Reagent | Concentration |
| D-MEM | |
D-MEM | |
| L-Glutamine | 580 μg/mL | L-Glutamine | 580 μg/mL |
| Glucose | 4.5 mg/mL | Glucose | 4.5 mg/mL |
| HEPES | 10 mM | HEPES | 10 mM |
| Gentamycin | 15 μg/mL | Gentamycin | 15 μg/mL |
| MEM | 0.1mM (1x) | ||
| FBS | 10% |
B. Miscellaneous Reagents:
| Reagent | Company | Order No |
| RPMI 1640 | Invitrogen Gibco® | REF 21875 |
| D-MEM | Invitrogen Gibco® | REF 41965 |
| Dulbecco´s PBS (10x) | PAA | Cat No H15-011 |
| Gencin® | Delta Select | Art No 7395800 |
| FBS | LONZA | Cat No DE14-802C |
| HEPES Buffer | PAA | Cat No S11-001 |
| MEM NEAA | Invitrogen Gibco® | REF 11140 |
| Hygromycin B | PAA | Cat No P02-015 |
| Recombinant Murine Interleukin-4 | Immunotools | Cat No 12340045 |
| Cyclosporin A | Novartis | Cat No NDC 0078-0109-01 |
| Trypsin/EDTA (10x) | Invitrogen Gibco® | REF 15400-054 |
C. Miscellaneous Supplies:
| Reagent | Company | Order No |
| Sterile pipette tips | Sarstedt | |
| 6-well plate | NUNC | Cat No 140675 |
| 50mL conical tube | BD Falcon™ | Cat No 352070 |
| Tissue culture flask | Sarstedt | Cat No 83.1813.002 |
Riferimenti
- Schultze, J. L. CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy. J Clin Invest. 100 (11), 2757-2765 (1997).
- Wiesner, M. Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation. PLoS ONE. 3, e1464-e1464 (2008).
- Kondo, E. Efficient generation of antigen-specific cytotoxic T cells using retrovirally transduced CD40-activated B cells. J Immunol. 169 (4), 2164-2171 (2002).
- Liebig, T. M., Fiedler, A., Zoghi, S., Shimabukuro-Vornhagen, A., Bergwelt-Baildon, M. S. Generation of human CD40-activated B cells. J Vis Exp. 32, (2009).
- von Bergwelt-Baildon, M. CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants. Blood. 107 (7), 2786-2789 (2006).
- Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells. Cancer Res. 63 (11), 2836-2843 (2003).
- Ahmadi, T., Flies, A., Efebera, Y., Sherr, D. H. CD40 Ligand-activated, antigen-specific B cells are comparable to mature dendritic cells in presenting protein antigens and major histocompatibility complex class I- and class II-binding peptides. Immunology. 124 (1), 129-140 (2008).
- Bergwelt-Baildon, M. S. v. o. n. Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application. Blood. 99 (9), 3319-3325 (2002).
- Kondo, E. CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential. Clin Exp Immunol. 155 (2), 249-256 (2009).
- Schultze, J. L., Grabbe, S., von Bergwelt-Baildon, M. S. DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy. Trends Immunol. 25 (12), 659-664 (2004).
- Mayr, C. Chromosomal translocations are associated with poor prognosis in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 107 (2), 742-751 (2006).
- Mason, N. J. RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma. Gene Ther. 15 (13), 955-965 (2008).
