Modello murino di CD40-attivazione delle cellule B
Summary
In questo video, dimostriamo la procedura di CD40-attivazione e l'espansione delle cellule B da splenociti murini di C57BL / 6 topi, che può essere utilizzato come modello di una cellula presentanti l'antigene (APC) per studiare l'induzione di immunità.
Abstract
La ricerca sulle cellule B CD40 ha dimostrato che l'attivazione di migliorare la loro capacità di presentazione dell'antigene. Se stimolati con interleuchina-4 e CD40 ligando (CD40L), le cellule B umane può essere ampliato senza difficoltà da piccole quantità di sangue periferico entro 14 giorni di tempo per grandi quantità di altamente puri-CD40 delle cellule B (> 10<sup> 9</sup> Cellule per paziente) da donatori sani e pazienti affetti da cancro<sup> 1-4</sup>. Cellule CD40-B esprimere importanti molecole nodo homing linfa e in grado di attrarre le cellule T<em> In vitro</em<sup> 5</sup>. Inoltre, essi occupano in modo efficiente, elaborare e presentare antigeni alle cellule T<sup> 6,7</sup>. Cellule CD40-B hanno dimostrato di non solo ingenuo primo, ma anche di espandere le cellule T di memoria<sup> 8,9</sup>. Pertanto CD40-attivate le cellule B (linfociti B CD40-) sono stati studiati come fonte alternativa di immuno-stimolatorie cellule presentanti l'antigene (APC) per i cellulari basati su immunotherapy1, 5,10. Per studiare ulteriormente se le cellule CD40-B inducono efficace le risposte delle cellule T in vivo e studiare il meccanismo di base abbiamo stabilito un sistema di coltura cellulare per la generazione di murino CD40 delle cellule B attivate. Utilizzando splenociti depurati o linfociti B di topi C57BL / 6 per CD40-attivazione, le condizioni ottimali sono stati identificati come segue: A partire da splenociti di C57BL / 6 topi (aplotipo H-2b) linfociti sono purificati mediante centrifugazione a gradiente di densità e di co-coltura con HeLa cellule che esprimono ricombinante murino ligando CD40 (tmuCD40L HeLa)<sup> 11</sup>. Le cellule sono recultured ogni 3-4 giorni e componenti chiave, quali CD40L, interleuchina-4,-mercaptoetanolo e ciclosporina A sono reintegrati. In questo protocollo dimostriamo come ottenere pienamente attivato murino CD40 delle cellule B (mCD40B) con simili APC-fenotipo di umani CD40 delle cellule B (Fig. 1a, b). CD40-stimolazione porta ad una conseguenza rapida espansione e di elevata purezza (> 90%) delle cellule CD19 + B entro 14 giorni di coltura cellulare (Fig. 1c, d). Per evitare la contaminazione con le cellule non transfettate, espressione del ligando CD40 murino sulla trasfettate deve essere controllata regolarmente (Fig. 2). Murino CD40-attivate le cellule B possono essere utilizzati per studiare l'attivazione delle cellule B e la differenziazione così come per indagare il loro potenziale di funzionare come APC in vitro e in vivo. Inoltre, essi rappresentano uno strumento promettente per stabilire la vaccinazione terapeutica o preventiva contro i tumori e contribuirà a rispondere a domande riguardanti la sicurezza e l'immunogenicità di questo approccio<sup> 12</sup>.
Protocol
Discussion
Le modifiche di questo protocollo sono possibili, soprattutto per quanto riguarda l'origine di CD40-stimolo e il tipo di ceppo di topi utilizzati, anche cedendo nella generazione efficiente di murini CD40 delle cellule B attivate. Ahmadi et al. hanno mostrato risultati simili per i fibroblasti di topo murine transfettate con CD40-ligando. In questa presentazione contesto di xeno-antigene può essere esclusa con certezza, ma studi approfonditi in materia di sicurezza e tossicità in vivo non ha dato segni di…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Dott. Clemens Wendtner per fornire tmuCD40-Ligand-HeLa linea cellulare.
Materials
A. Preparation of Media:
| Feeder cell wild type medium | Feeder cell selection medium | ||
| Reagent | Concentration | Reagent | Concentration |
| RPMI 1640 | RPMI 1640 | ||
| L-Glutamine | 300 μg/mL | L-Glutamine | 300 μg/mL |
| FBS | 10 % | FBS | 10 % |
| HEPES | 10 mM | HEPES | 10 mM |
| Gentamycin | 15 μg/mL | Gentamycin | 15 μg/mL |
| Hygromycin B | 0.2 mg/mL |
| mCD40-B washing medium | mCD40-B culture medium | ||
| Reagent | Concentration | Reagent | Concentration |
| D-MEM | |
D-MEM | |
| L-Glutamine | 580 μg/mL | L-Glutamine | 580 μg/mL |
| Glucose | 4.5 mg/mL | Glucose | 4.5 mg/mL |
| HEPES | 10 mM | HEPES | 10 mM |
| Gentamycin | 15 μg/mL | Gentamycin | 15 μg/mL |
| MEM | 0.1mM (1x) | ||
| FBS | 10% |
B. Miscellaneous Reagents:
| Reagent | Company | Order No |
| RPMI 1640 | Invitrogen Gibco® | REF 21875 |
| D-MEM | Invitrogen Gibco® | REF 41965 |
| Dulbecco´s PBS (10x) | PAA | Cat No H15-011 |
| Gencin® | Delta Select | Art No 7395800 |
| FBS | LONZA | Cat No DE14-802C |
| HEPES Buffer | PAA | Cat No S11-001 |
| MEM NEAA | Invitrogen Gibco® | REF 11140 |
| Hygromycin B | PAA | Cat No P02-015 |
| Recombinant Murine Interleukin-4 | Immunotools | Cat No 12340045 |
| Cyclosporin A | Novartis | Cat No NDC 0078-0109-01 |
| Trypsin/EDTA (10x) | Invitrogen Gibco® | REF 15400-054 |
C. Miscellaneous Supplies:
| Reagent | Company | Order No |
| Sterile pipette tips | Sarstedt | |
| 6-well plate | NUNC | Cat No 140675 |
| 50mL conical tube | BD Falcon™ | Cat No 352070 |
| Tissue culture flask | Sarstedt | Cat No 83.1813.002 |
Riferimenti
- Schultze, J. L. CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy. J Clin Invest. 100 (11), 2757-2765 (1997).
- Wiesner, M. Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation. PLoS ONE. 3, e1464-e1464 (2008).
- Kondo, E. Efficient generation of antigen-specific cytotoxic T cells using retrovirally transduced CD40-activated B cells. J Immunol. 169 (4), 2164-2171 (2002).
- Liebig, T. M., Fiedler, A., Zoghi, S., Shimabukuro-Vornhagen, A., Bergwelt-Baildon, M. S. Generation of human CD40-activated B cells. J Vis Exp. 32, (2009).
- von Bergwelt-Baildon, M. CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants. Blood. 107 (7), 2786-2789 (2006).
- Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells. Cancer Res. 63 (11), 2836-2843 (2003).
- Ahmadi, T., Flies, A., Efebera, Y., Sherr, D. H. CD40 Ligand-activated, antigen-specific B cells are comparable to mature dendritic cells in presenting protein antigens and major histocompatibility complex class I- and class II-binding peptides. Immunology. 124 (1), 129-140 (2008).
- Bergwelt-Baildon, M. S. v. o. n. Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application. Blood. 99 (9), 3319-3325 (2002).
- Kondo, E. CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential. Clin Exp Immunol. 155 (2), 249-256 (2009).
- Schultze, J. L., Grabbe, S., von Bergwelt-Baildon, M. S. DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy. Trends Immunol. 25 (12), 659-664 (2004).
- Mayr, C. Chromosomal translocations are associated with poor prognosis in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 107 (2), 742-751 (2006).
- Mason, N. J. RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma. Gene Ther. 15 (13), 955-965 (2008).
