Imaging Mismatch Reparation och cellulära svaren på DNA-skador i Bacillus subtilis</em

Summary

Ett detaljerat protokoll beskrivs för bildhantering i realtid bildning av DNA-reparation i<em> Bacillus subtilis</em> Celler.

Abstract

Både prokaryoter och eukaryoter svara på DNA-skador genom en komplex uppsättning av fysiologiska förändringar. Förändringar i genuttryck, omfördelning av befintliga proteiner och montering av nya proteinkomplex kan stimuleras av olika DNA-skador och missmatchad DNA par bas. Fluorescensmikroskopi har använts som ett kraftfullt experimentell verktyg för att visualisera och kvantifiera dessa och andra svar på DNA-skador och även övervaka status DNA-replikation inom den komplexa subcellulära arkitekturen i en levande cell. Translationell fusioner mellan fluorescerande reporter proteiner och delar av DNA-replikation och reparation maskiner har använts för att bestämma ledtrådar som mål-DNA reparation proteiner till deras likartade lesioner<em> In vivo</em> Och att förstå hur dessa proteiner är organiserade inom bakterieceller. Dessutom har transkriptionell och translationell fusioner kopplade till inducerbara DNA-skador initiativtagarna avslöjat vilka celler inom en population har aktiverat genotoxisk stressreaktioner. I denna granskning ger vi ett detaljerat protokoll för användning fluorescensmikroskopi att bilden montering av DNA-reparation och DNA komplex replikering i enstaka bakterieceller. Framför allt fokuserar detta arbete på bildbehandling proteiner mismatch reparation, homolog rekombination, DNA-replikering och en SOS-inducible protein i<em> Bacillus subtilis</em>. Alla de förfaranden som beskrivs här kan lätt bli föremål för avbildning proteinkomplex i en mängd olika bakteriearter.

Protocol

Växande cellkulturer för mikroskopi 1. En eller två dagar före bildhantering, förbereda B. subtilis stam innehåller translationell fusionsproteinet du vill visualisera. Trial rundor av steg 1A och 1B kommer att bli nödvändigt att avgöra vilken tillväxt tillstånd ger de bästa bilderna på din stam. I de flesta fall bör celler avbildas under exponentiell tillväxtfas. För vissa B. subtilis stammar (i synnerhet stammar som växer dåligt…

Discussion

Trial and error är skyldiga att hitta exponeringsförhållanden för bilder med högsta kvalitet för varje stam, finner vi att en millisekund är lämpligt för vitt ljus bilder, medan exponering på 100 till 2000 ms är lämpliga för GFP (FITC) och FM4-64 (TRITC ) bilder. Exponeringstiden varierar beroende på vilken utrustning för bildåtergivning. Vi rekommenderar användning av en stam per 15-och objektglas för den enklaste bildhantering, som pad kvalitet och spridning av celler från plattan gränsen kan kompl…

Materials

Specific solution recipes¹:

10x S7₅₀ salts
0.5 M MOPS
100 mM Ammonium Sulfate
50 mM Potassium Phosphate Monobasic
Filter sterilize, and wrap S7₅₀ media in foil prior to storage

100x Metals
0.2 M MgCl₂
70 mM CaCl₂
5 mM MnCl₂
0.1 mM ZnCl₂
100 μg/mL Thiamine HCl
2 mM HCl
0.5 mM FeCl₃*
dH₂O to final volume
*FeCl₃ should be added last, to prevent precipitation.
After filter sterilization, wrap 100x Metal solution in foil.

S7₅₀ media
1x S7₅₀ salts
1x Metal
1% Glucose
0.1% Glutamate
40 μg/mL Tryptophan
40 μg/mL Phenylalanine
distilled H₂O to final volume

10x Spizizens (grams/L)
151.4 mM Ammonium Sulfate (20g/L)
803.8 mM Potassium Phosphate Monobasic (140g/L)
440.9 mM Potassium Phosphate Dibasic (60g/L)
34.0 mM Sodium Citrate (10g/L)
16.6 mM MgSO₄ (2g/L)
dH₂O to final volume
Filter sterilize