Questo protocollo video illustra la tecnica di zucca utilizzata in laboratorio per preparare Johansen Drosophila Cromosomi politenici per l'etichettatura degli anticorpi.
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Articolo metodologico
Preparazione dei cromosomi di Drosophila Zucche politene per l'etichettatura di anticorpi
In questo articolo
Sommario
Abstract
Drosophila è stata a lungo un sistema di preferiti modello per studiare la relazione tra struttura della cromatina e regolazione dei geni per i vantaggi citologico fornite dal cromosomi giganti ghiandola salivare polytene larve del terzo stadio. In questo tessuto i cromosomi subiscono molti cicli di replicazione in assenza di divisione cellulare dando luogo a circa 1000 copie. Il DNA rimane allineata dopo ogni ciclo replicativo conseguente cromosomi notevolmente allargata che forniscono una opportunità unica per correlare morfologia della cromatina con la localizzazione di specifiche proteine. Di conseguenza, c'è stato un elevato livello di interesse nella definizione delle modificazioni epigenetiche presenti in geni diversi e in diverse fasi del processo di trascrizione. Un importante strumento per tali studi è l'etichettatura dei cromosomi politenici con anticorpi per l'enzima, fattore di trascrizione o la modifica degli istoni di interesse. Questo protocollo video illustra la tecnica di zucca utilizzata in laboratorio per preparare Johansen Drosophila cromosomi politenici per l'etichettatura degli anticorpi.
Protocollo
Il protocollo seguito per la preparazione di politene da squash cromosoma è adattato dalla procedura descritta in Johansen et al. (2009).
1. Cultura del terzo larve instar Drosophila
Al fine di ottenere ottimali cromosomi politenici per le preparazioni di alta qualità da squash, condizioni di coltura poco affollate sono essenziali (cioè, posto a circa 20 la deposizione delle uova le mosche femmina in uno standard 4 "bottiglia di volare e passare a una nuova bottiglia ogni giorno). Selezionare la più grassa individui dal primo raccolto di arrampicata 3 larve instar mentre sono ancora vaganti, ma....
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Discussione
L'inclusione degli acidi acetico e lattico in protocolli convenzionali fissazione da squash facilita sia la risoluzione interbanda e braccio cromosomico diffusione ma purtroppo alcuni epitopi non sopravvivono a questo trattamento. Un esempio di tale epitopo è H3S10ph (Cai et al., 2008). Poiché il trattamento acido ha anche lo svantaggio che disseta la fluorescenza intrinseca di proteine GFP-tagged, DiMario et al. (2006) ha recentemente sviluppato una base di formaldeide "acid-free tecnica di.......
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Ringraziamenti
Ringraziamo la signora V. Lephart di mantenimento delle scorte volare Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes for Health di sovvenzione (GM62916) e la National Science Foundation di sovvenzione (MCB0817107).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Riferimenti
- Cai, W., Bao, X., Deng, H., Jin, Y., Girton, J., Johansen, J., Johansen, K. M. RNA polymerase II-mediated transcription at active loci does not require histone H3S10 phosphorylation in Drosophila. Development. 135, 2917-2925 (2008).
- DiMario, P., Rosby, R., Cui, Z.
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Ristampe e permessi
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