Preparação de Abóboras Drosophila cromossomos politênicos para Rotulagem de anticorpos
Summary
Este protocolo de vídeo ilustra a técnica de squash usado em laboratório para preparar Johansen<em> Drosophila</em> Cromossomos politênicos para a rotulagem de anticorpos.
Abstract
Drosophila tem sido um modelo de sistema favorito para estudar a relação entre estrutura da cromatina e regulação de genes devido às vantagens citológicos fornecidos pela gigante cromossomos politênicos da glândula salivar de larvas de terceiro ínstar. Neste tecido dos cromossomos passar por muitos ciclos de replicação, na ausência de divisão celular dando origem a cerca de 1000 cópias. O DNA permanece alinhada após cada ciclo replicativo, resultando em cromossomos muito alargada que fornecem uma oportunidade única para correlacionar a morfologia da cromatina com a localização de proteínas específicas. Conseqüentemente, tem havido um alto nível de interesse na definição das modificações epigenéticas presente em genes diferentes e em diferentes estágios do processo de transcrição. Uma ferramenta importante para esses estudos é a rotulagem dos cromossomos politênicos com anticorpos para a enzima, fator de transcrição, ou modificação das histonas de interesse. Este protocolo de vídeo ilustra a técnica de squash usado no laboratório de Johansen para preparar cromossomos politênicos de Drosophila para a rotulagem de anticorpos.
Protocol
Discussion
A inclusão de ácido acético e láctico em protocolos convencionais de fixação de squash facilita tanto a resolução interband e braço cromossômico de propagação mas infelizmente alguns epítopos não sobrevivem este tratamento. Um exemplo de tal é um epítopo H3S10ph (Cai et al., 2008). Uma vez que o tratamento com ácido também tem a desvantagem de que sacia a fluorescência inerente de proteínas GFP, DiMario et al. (2006) desenvolveu recentemente um formaldeído-based "técnica de s…
Acknowledgements
Agradecemos a Sra. V. Lephart para manutenção de estoques voar Este trabalho foi financiado pelo National Institutes for Health subvenção (GM62916) e National Science Foundation subvenção (MCB0817107).
Riferimenti
- Cai, W., Bao, X., Deng, H., Jin, Y., Girton, J., Johansen, J., Johansen, K. M. RNA polymerase II-mediated transcription at active loci does not require histone H3S10 phosphorylation in Drosophila. Development. 135, 2917-2925 (2008).
- DiMario, P., Rosby, R., Cui, Z. Direct visualization of GFP-fusion proteins on polytene chromosomes. Dros. Inf. Serv. 89, 115-118 (2006).
- Johansen, K. M., Cai, W., Deng, H., Bao, X., Zhang, W., Girton, J., Johansen, J. Methods for studying transcription and epigenetic chromatin modification in Drosophila polytene chromosome squash preparations using antibodies. Methods. 48, 387-397 (2009).
