外植片から成長した初代ヒト気管支上皮細胞
Summary
ここでは気液界面上で差別化された成長を含むヒト気管支気道組織の外植片から初代ヒト気管支上皮細胞を成長させるための詳細な方法について説明します。このメソッドは、人間の肺の健康と疾患における気道上皮の役割を調査するための主要な細胞の豊富なソースを提供します。
Abstract
ヒト気管支上皮細胞は、疾患の細胞モデルのために必要であるとヒト上皮細胞の機能と構造に賦形剤及び薬理学的薬剤の効果を調査する。ここでは詳細に肺の手術（例えば肺癌や肺容量減少手術）の時に外科医によって収穫された気管支気道組織から気管支上皮細胞を成長させる方法を説明します。倫理の承認とインフォームドコンセントと、外科医は、病理学に必要なものを取り、病気の分野から離れている気管支の部分を提供してくれます。組織は、文化の中で主要な気管支上皮細胞を成長させるために使用できる外植片のソースとして使用されます。 0.5〜1センチメートル長く、直径≤約1cm気管支セグメントは、冷たいEBSSで洗浄され、過剰実質組織が削除されます。セグメントは、オープンカットと2〜3ミリメートルに刻まれている<sup> 3</sup>組織片。作品は、初代細胞のソースとして使用されています。コラーゲンの組み合わせ（30μg/ mlの）、フィブロネクチン（10μg/ ml）を、とBSA（10μg/ ml）を持つ1〜2時間のためのコーティング100ミリメートル培養プレートの後、プレートを4〜5分野と組織に傷が付いて部分に傷が領域に配置され、5％COで、その後、上皮細胞増殖に適した培地（添加DMEM /ハムF – 12）を添加し、プレートを37℃インキュベーター内に配置されます° Cを<sub> 2</sub>加湿空気。培地は3〜4日ごとに変更されます。上皮細胞は3-4週間で約1.5cmの直径のリングを形成する部分から成長する。外植片は、新しいプレコートプレートにそれらを移動して6回まで再使用することができます。細胞は、トリプシン/ EDTAを用いて持ち上げプール、カウント、およびその数を増加するためにT75細胞のバインドフラスコに再播種されています。 2〜3000000細胞を接種したT75フラスコは4週間で80％コンフルエントに成長する。拡張された初代ヒト上皮細胞を培養し、気液界面での差別を許可することができます。メソッドは、新たに単離した組織からのヒト気管支上皮細胞の豊富なソースを提供し、病気のモデルとしてこれらの細胞を研究するために、薬理学および毒物学のスクリーニングのための許可ここで説明する。
Protocol
Discussion
本研究では、文化と初代ヒト気管支上皮細胞の拡大のための詳細な方法を提示した。我々は、上皮細胞の増殖を促進する培地で培養外植片と気管支組織の移植は、、（気液界面上に成長した）非差別（水中）と分化した細胞モデルの研究のためのヒト気道上皮細胞の連続的なソースを提供する方法を実証。これらの細胞は、より密接に彼らの実際の生理的環境での細胞のようになっているこ?…
Acknowledgements
著者らは、気管支の組織を提供するための博士リチャードInculetに非常に感謝しています。研究倫理審査会の承認は、聖ヨセフのヘルスケアハミルトンとウェスタンオンタリオ/ロンドン健康科学センター（デビッドマコーマック）、ティッシュやアーカイブ委員会、病理部の大学から得た。我々はまた、免疫染色に必要な材料のいくつかを提供する私たちのALI培養の通信機器メーカー、およびダニエラのファーカスを提供するためのアーニースピッツァーを（電子顕微鏡、マクマスター大学）に感謝します。この作品は、オンタリオ州胸部学会からのブロックの用語の助成金によって賄われていた博士はアスマヤギ氏はFSORC奨学金、聖ヨセフのヘルスケア、ハミルトン、オンタリオ州、カナダによってサポートされていました。
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Albumin from bovine serum, powder | Sigma | A4919 | Use for coating solution | |
| COLLAGEN TYPE I 0.1% Solution Sterile-filtered | Sigma | C8919 | Use for coating solution | |
| Fibronectin from human plasma | Sigma | F2006 | Use for coating solution | |
| Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS, sterile) | Sigma | 28888 | Use for rinsing tissue and for coating solution | |
| DMEM/Ham F-12 | Sigma | D8437 | ||
| FBS | Sigma | F1015 | Inactivate, then aliquot and freeze (-20°C); use fresh when needed | |
| Antibiotic-Antimycotic Stabilized | Sigma | A5955 | Aliquot into 2 ml vials and freeze (-20°C); use fresh when needed | |
| Albumin solution from bovine serum | Sigma | A8412 | BSA | |
| Pituitary Extract Bovine | Sigma | P1476 | BPE | |
| Epidermal growth factor | Sigma | E9644 | EGF | |
| (±)-Epinephrine | Sigma | E1635 | ||
| Insulin | Sigma | I6634 | ||
| Tranferrin Human | Sigma | T8158 | ||
| Triiodo-L-thyronine | Sigma | T6397 | ||
| Hydorcortisone | Sigma | H0888 | ||
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | ||
| Trypsin | Sigma | T9935 | ||
| EDTA | Sigma | E6758 | EDTA | |
| Phosphate buffered saline | Sigma | P5368 | PBS | |
| 70% ethanol | Use for disinfecting and cleaning | |||
| 24 well Transwells | Corning | 3470 | ||
| Cell Culture Flasks (T75) CLLBND from Corning | Fisher Scientific | 05-539-104 | These flasks have a Cell Bind coating which promotes cell attachment and growth | |
| Monoclonal Anti-Cytokeratin, pan-FITC antibody | Sigma | F3418 | Permeabilization: 0.2% TRITON X-100/PBS; Use 1:250 dilution | |
| Antibody: E-Cadherin (H108) | Santa Cruz | sc-7870 | Do not permeabilize; Use 1:250 dilution and A21207 (Invitrogen) as secondary antibody | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG | Invitrogen | A21207 | Use 1:400 dilution | |
| Antibody: Monoclonal mouse Anti- α-Smooth Muscle Actin-Cy3 | Sigma- Aldrich | C6198 | Permeabilization: 0.2% TRITON X-100/PBS; Use 1:100 dilution | |
| Antibody: Vimentin (RV202) | Santa Cruz | Sc-32322 | Permeabilization: 0.2% TRITON X-100/PBS; Use 1:100 dilution and T2402 (Sigma- Aldrich) as secondary antibody | |
| Rabbit anti-mouse TRITC | Sigma- Aldrich | T2402 | Use 1:400 dilution | |
| Antibody: CD31 or PECAM-1 (M-20) | Santa-Cruz | Sc-1506 | Do not permeabilize; Use 1:200 dilution and Donkey anti-goat IgG-FITC as secondary antibody | |
| Donkey anti-goat IgG-FITC | Santa-Cruz | Use 1:100 dilution | ||
| Vectashield Mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Refrigerate in the dark; stains nuclei and retains fluorescence during prolonged storage | |
| Vectashield Mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | Refrigerate in the dark; retains fluorescence during prolonged storage | |
| Hoechst Stain solution | Sigma | H6024 | Stains nuclei; use 1:10 dilution and Vectashield H-1000 |
Other requirements: incubator, biological safety cabinet (BSC), centrifuge, 100mm culture plates, sterile tubes (15 ml, 50 ml, and 2 ml), sterile pipette tips, scalpel handle and blades, small sharp scissors, lab coats and gloves. These can be obtained from your preferred suppliers.
Riferimenti
- Phillips, J. Growing Cells on Transwell Inserts – Tips and Techniques [Internet]. Corning Life Sciences, Technical Resources, Online Training. , (2008).
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- Lechner, J. F., Haugen, A., McClendon, I. A., Pettis, E. W. Clonal growth of normal adult human bronchial epithelial cells in a serum-free medium. In Vitro. 18, 633-642 (1982).
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- Wetering, S. v. a. n. Regulation of secretory leukocyte proteinase inhibitor (SLPI) production by human bronchial epithelial cells: increase of cell-associated SLPI by neutrophil elastase. J. Investig. Med. 48, 359-366 (2000).
- Tristram, D. A., Hicks, W., Hard, R. Respiratory syncytial virus and human bronchial epithelium. Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 124, 777-783 (1998).
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- Freshney, R. I., Freshney, R. I. . Culture of epithelial cells. , 1-23 (1992).
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