Primär mänskliga Bronkial epitelceller vuxit från explants
Summary
Här beskriver vi en detaljerad metod för att odla primärt mänskligt bronkial epitelceller från explants mänskliga bronkiell luftvägar vävnad inklusive differentierad tillväxt på en luft-vätska gränssnitt. Denna metod ger en rik källa av galvaniska element för att undersöka den roll som slemhinnan i människans lunga hälsa och sjukdom.
Abstract
Mänskliga bronkial epitelceller behövs för cell modeller av sjukdom och att undersöka effekten av hjälpämnen och farmakologiska agenter på funktion och struktur av mänskliga epitelceller. Här beskriver vi i detalj den metod för växande bronkiell epitelceller från luftrören luftvägarna vävnad som skördas av kirurgen vid tiden för lungkirurgi (t.ex. lungcancer eller lungvolym minskning kirurgi). Med etik godkännande och informerat samtycke, tar kirurgen vad som behövs för patologi och ger oss en bronkial del som är långt från den sjuka områden. Vävnaden används sedan som en källa till explants som kan användas för odling av primära bronkerna epitelceller i kulturen. Bronkial segmenten ca 0,5-1cm lång och ≤ 1 cm i diameter sköljas med kallt EBSS och överflödigt parenkymvävnaden tas bort. Segment skärs öppna och finfördelats 2-3mm<sup> 3</sup> Bitar av vävnad. Bitarna används som en källa till primära celler. Efter beläggning 100mm odlingsplattor under 1-2 tim med en kombination av kollagen (30 mikrogram / ml), fibronektin (10 mikrogram / ml) och BSA (10 mikrogram / ml), är plattorna repade i 4-5 områden och vävnad stycken är placerade i repade områden, så odlingsmedium (DMEM / Ham F-12 med tillsatser) lämplig för epitelceller tillväxt tillsätts och tallrikar placeras i en inkubator vid 37 ° C i 5% CO<sub> 2</sub> Fuktad luft. Odlingsmediet byts var 3-4 dagar. Epitelceller växa från bitarna som bildar ca 1,5 ringar cm diameter i 3-4 veckor. Explants kan återanvändas upp till 6 gånger genom att flytta dem till nya pre-plåt. Celler lyfts med hjälp av trypsin / EDTA, poolade, räknad och åter klädd i T75 kolvar Cell Bind för att öka deras antal. T75 kolvar seedad med 2-3 miljoner celler att växa till 80% confluence i 4 veckor. Utökad primära humana epitelceller kan odlas och får skilja på luft-vätske-gränssnitt. Metoder som beskrivs här ger en rik källa av mänskliga bronkiell epitelceller från nyligen isolerade vävnader och möjliggör för att studera dessa celler som modeller för sjukdomen och för farmakologi och toxikologi screening.
Protocol
Discussion
I denna studie har vi lagt fram detaljerade metoder för kultur och utbyggnad av primära mänskliga bronkial epitelceller. Vi visade hur explants och transplantationer av bronkiell vävnad, odlade i media som främjar epitelceller tillväxt, kan ge en ständig källa till människans luftvägar epitelceller för studier av icke-differentierade (nedsänkt) och differentierad (som växer på luft-vätske-gränssnitt) cellmodeller . Dessa celler kan användas i system drogtester som mer liknar de celler i deras verkliga f…
Acknowledgements
Författarna är mycket tacksamma till Dr Richard Inculet för att tillhandahålla bronkial vävnader. Forskningsetisk nämnd godkännanden har erhållits från St Josephs Healthcare Hamilton och The University of Western Ontario / London Health Sciences Centre (Dr David McCormack), vävnader och arkiv kommittén, avdelningen för patologi. Vi tackar också Ernie Spitzer (elektronmikroskopi, McMaster University) att ställa TEM av våra ALI kulturer och Daniela Farkas för att ge några av de material som behövs för immunfärgning. Detta arbete har finansierats av ett block term bidrag från Ontario Thoracic Society, Dr Asma Yaghi stöddes av en FSORC stipendium, St Josephs Healthcare, Hamilton, Ontario, Kanada.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Albumin from bovine serum, powder | Sigma | A4919 | Use for coating solution | |
| COLLAGEN TYPE I 0.1% Solution Sterile-filtered | Sigma | C8919 | Use for coating solution | |
| Fibronectin from human plasma | Sigma | F2006 | Use for coating solution | |
| Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS, sterile) | Sigma | 28888 | Use for rinsing tissue and for coating solution | |
| DMEM/Ham F-12 | Sigma | D8437 | ||
| FBS | Sigma | F1015 | Inactivate, then aliquot and freeze (-20°C); use fresh when needed | |
| Antibiotic-Antimycotic Stabilized | Sigma | A5955 | Aliquot into 2 ml vials and freeze (-20°C); use fresh when needed | |
| Albumin solution from bovine serum | Sigma | A8412 | BSA | |
| Pituitary Extract Bovine | Sigma | P1476 | BPE | |
| Epidermal growth factor | Sigma | E9644 | EGF | |
| (±)-Epinephrine | Sigma | E1635 | ||
| Insulin | Sigma | I6634 | ||
| Tranferrin Human | Sigma | T8158 | ||
| Triiodo-L-thyronine | Sigma | T6397 | ||
| Hydorcortisone | Sigma | H0888 | ||
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | ||
| Trypsin | Sigma | T9935 | ||
| EDTA | Sigma | E6758 | EDTA | |
| Phosphate buffered saline | Sigma | P5368 | PBS | |
| 70% ethanol | Use for disinfecting and cleaning | |||
| 24 well Transwells | Corning | 3470 | ||
| Cell Culture Flasks (T75) CLLBND from Corning | Fisher Scientific | 05-539-104 | These flasks have a Cell Bind coating which promotes cell attachment and growth | |
| Monoclonal Anti-Cytokeratin, pan-FITC antibody | Sigma | F3418 | Permeabilization: 0.2% TRITON X-100/PBS; Use 1:250 dilution | |
| Antibody: E-Cadherin (H108) | Santa Cruz | sc-7870 | Do not permeabilize; Use 1:250 dilution and A21207 (Invitrogen) as secondary antibody | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG | Invitrogen | A21207 | Use 1:400 dilution | |
| Antibody: Monoclonal mouse Anti- α-Smooth Muscle Actin-Cy3 | Sigma- Aldrich | C6198 | Permeabilization: 0.2% TRITON X-100/PBS; Use 1:100 dilution | |
| Antibody: Vimentin (RV202) | Santa Cruz | Sc-32322 | Permeabilization: 0.2% TRITON X-100/PBS; Use 1:100 dilution and T2402 (Sigma- Aldrich) as secondary antibody | |
| Rabbit anti-mouse TRITC | Sigma- Aldrich | T2402 | Use 1:400 dilution | |
| Antibody: CD31 or PECAM-1 (M-20) | Santa-Cruz | Sc-1506 | Do not permeabilize; Use 1:200 dilution and Donkey anti-goat IgG-FITC as secondary antibody | |
| Donkey anti-goat IgG-FITC | Santa-Cruz | Use 1:100 dilution | ||
| Vectashield Mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Refrigerate in the dark; stains nuclei and retains fluorescence during prolonged storage | |
| Vectashield Mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | Refrigerate in the dark; retains fluorescence during prolonged storage | |
| Hoechst Stain solution | Sigma | H6024 | Stains nuclei; use 1:10 dilution and Vectashield H-1000 |
Other requirements: incubator, biological safety cabinet (BSC), centrifuge, 100mm culture plates, sterile tubes (15 ml, 50 ml, and 2 ml), sterile pipette tips, scalpel handle and blades, small sharp scissors, lab coats and gloves. These can be obtained from your preferred suppliers.
Riferimenti
- Phillips, J. Growing Cells on Transwell Inserts – Tips and Techniques [Internet]. Corning Life Sciences, Technical Resources, Online Training. , (2008).
- Turi, J. L. Oxidative stress activates anion exchange protein 2 and AP-1 in airway epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol. Physiol. 283, L791-L798 (2002).
- Lechner, J. F., Haugen, A., McClendon, I. A., Pettis, E. W. Clonal growth of normal adult human bronchial epithelial cells in a serum-free medium. In Vitro. 18, 633-642 (1982).
- Yoshisue, H. Characterization of ciliated bronchial epithelium 1, a ciliated cell-associated gene induced during mucociliary differentiation. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 31, 491-500 (2004).
- Wetering, S. v. a. n. Regulation of secretory leukocyte proteinase inhibitor (SLPI) production by human bronchial epithelial cells: increase of cell-associated SLPI by neutrophil elastase. J. Investig. Med. 48, 359-366 (2000).
- Tristram, D. A., Hicks, W., Hard, R. Respiratory syncytial virus and human bronchial epithelium. Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 124, 777-783 (1998).
- Mattinger, C., Nyugen, T., Schafer, D., Hormann, K. Evaluation of serum-free culture conditions for primary human nasal epithelial cells. Int. J. Hyg. Environ. Health. 205, 235-238 (2002).
- Freshney, R. I., Freshney, R. I. . Culture of epithelial cells. , 1-23 (1992).
- Freshney, R. I., Freshney, R. I. Normal human bronchial epithelial cell cultures in Culture of specialized cells series. Culture of epithelial cells. , 181-196 (1992).
