식물 세포 벽의 종합 작곡 분석 (리그노셀룰로오스성 바이오 매스) 2 부 : 탄수화물

Summary

식물 바이오 매스는 바이오 연료 생산에 사용될 수있는 주요 탄소 중립 되살릴 수있는 자원입니다. 식물 바이오 매스는 주로 세포 벽, lignocellulosics를 칭했다 구조적으로 복잡한 복합 재료로 구성되어 있습니다. 여기서 우리는 콘텐츠와 벽 파생 탄수화물의 구성의 포괄적인 분석을 위해 프로토콜을 설명합니다.

Abstract

재생, 탄소 중립, 그리고 산업과 사회에 대한 지속적인 원료의 필요성은 21 세기의 가장 눌러 문제 중 하나가되고있다. 이것은 교통 액체 연료의 생산을위한 산업 원료 등 공장 제품의 사용에 흥미를 rekindled있다<sup> 2</sup이러한 biocomposite 자료 등> 및 기타 제품⁶. 식물 바이오 매스는 지구상에서 가장 큰 미개척 보유 중 하나 남아있다⁴. 그것은 주로 에너지 셀룰로오스를 포함한 다양한 고분자 다양한 hemicelluloses 및 폴리페놀 리그닌 구성되어 있으며 세포 벽 구성됩니다⁵ 때문에 때로는 lignocellulosics를 칭했다. 그러나, 식물의 세포 벽을 벽에 강도와 전체 식물의 구조적 무결성에 광범위하게 기여로 저하에 완강히 저항하는 것으로 진화했습니다. 의 필요한 강성에도 불구하고, 세포 벽이 metabolically 활성 및 식물의 성장과 분화와 같은 다양한 세포 활동에 중요한 역할을 담당하고 매우 역동적인 실체이다⁵. 벽의 다양한 기능으로 인해 엄청난 구조적 다양성은 단일 플랜트 내의 다른 식물 종의 및 세포 유형의 벽 안에있다⁴. 따라서 농작물 종, 작물 다양성, 또는 식물의 조직이 biorefinery 사용되는 무엇에 따라, 화학 / 효소 프로세스와 액체 바이오 연료에 대한 다양한 설탕의 후속 발효에 의해 depolymerisation에 대한 처리 단계 조정하고 최적화해야합니다. 이 사실 뒷받침 식물 바이오 매스 feedstocks의 철저한 특성화를위한 필요합니다. 여기 lignocellulosics의 구성의 결정을 가능하게 높은 처리량 분석 매체 (그림 1) 의무가있는 포괄적인 분석 방법을 설명합니다. 방법은 destarched 세포 벽 재료 준비와 함께 시작합니다. 그 결과 lignocellulosics는 다음의 hemicelluloses의 monosaccharide 구성 및 기타 매트릭스 polysaccharides1하고, 결정 셀룰로오스의 내용을 확인하기 위해 갈라 아르⁷. 리그노셀룰로오스성 바이오 매스의 리그닌 구성 요소를 분석하는 프로토콜은 부분을 설명합니다 I³.

Protocol

1. 세포 벽 절연 갈기 대략 60 – 70mg의 공기 또는 retschmill (1 분, 25 Hz에서)를 사용하여 2ml sarstedt 스크류 캡 튜브에 5.5 mm 스테인레스 스틸 공 건조 식물 자료를 동결. 대안은 높은 처리량 연삭 및 로봇 칭했다 iWall을 분배의 사용은 부 3에 설명되어 있습니다. 세포 벽 절연 절차를 계속하기 전에 강철 공을 제거 세포 벽 재료의 준비의 상세한 프로토콜은 부 3 표시됩니다. 여기에 완성도 프로토콜의 서면 단계를하십시오. 1.5 70% 수성 에탄올의 ML, 그리고 철저하게 소용돌이를 추가 펠렛 10 분 알코올 불용성 잔류물을 위해 10,000 RPM에서 원심 분리기 뜨는을 대기음 또는 가만히 따르다 잔류물에 클로로포름 / 메탄올 (1:1 V / V) 솔루션의 1.5 ML를 추가하고 펠렛을 resuspend하기 위해 철저하게 튜브를 흔들 10 분 10,000 rpm으로 원심 분리기 및 뜨는을 대기음 또는 가만히 따르다 아세톤 500 UL에 resuspend 펠릿 35 공기의 흐름과 용매를 증발 ° C를 건조까지 필요한 건조 표본은 추가 처리까지 방 온도에서 저장될 수있다면. 예제 0.1 M sodiumacetate 버퍼 산도 5.0 1.5 ML에 다시 중지 펠렛에서 전분의 제거를 시작합니다. 20 분 대한 sarstedt 튜브와 열을 모자. 80 ° C 가열 블록에. 얼음 정지 냉각 펠렛 다음 에이전트를 추가합니다 : 35 0.01 % Sodiumazide의 μl (난 3), 35 μl 아밀라아제 (50 μg/1mL H 2 O, 바실러스 종, 시그마), 17 μl Pullulanase (바실러스 acidopullulyticus에서 18.7 단위, 시그마) . 튜브와 철저하게 소용돌이를 캡. 정지 37 박 이상 incubated입니다 ° 통에 C. 튜브를 Orienting 수평 보좌관은 혼합 향상. 100 열 정지 ° C 소화를 종료하기 위해 가열 블록에서 10 분. 원심 분리기 (10,000 RPM, 10 분) 및 폐기 뜨는 포함 solubilized 전분 , 1.5 ML 물을 추가 vortexing, centriguation 및 세척 물을 decanting하여 나머지 펠렛을 세 번 씻으십시오. 아세톤 500 UL에 resuspend 펠릿 건조까지 35 공기의 흐름 ° C로 용매를 증발. 그것은 더 건조 주걱으로 튜브에 재료를 헤어지게하는 것도 필요할 수 있습니다. 마른 재료는 절연 세포 벽 (lignocellulosics)를 제공합니다. 필요한 건조 표본은 추가 처리까지 방 온도에서 저장될 수있다면. 2. 매트릭스 다당류 성분 이 방법은 기본적으로 Albersheim 1 발행 방식의 변경이다. 벽 소재의 monosaccharide 구성을 확인하려면 직접 또는 iWall, 로봇 분쇄 및 무게 로봇을 사용하여 highthroughput 방식 중 2ml starstedt 튜브에 세포 벽 재료 2 MG 나가는거야. 내부 표준으로 이노시톨 솔루션 (5mg/ml) 20 UL을 추가합니다. 2 MG 세포 벽 샘플을 위해 100 UG를 추가하는 것이 좋습니다. 튜브의 바닥에있는 세포 벽 자료를 수집하는 아세톤 250 UL과 튜브 벽을 씻어하고, 공기에서 아세톤은 매우 부드러운 증발. 약한 산성 가수 분해에 대한 각각의 샘플에 2M trifluoroacetic 산성 (TFA) 250 UL를 추가합니다. 어떤 물질이 튜브 벽에까지 치켜하지 않도록 신중하게 TFA를 추가합니다. 단단히 뚜껑 121 90 분 품어 ° 가열 블록의 C. 얼음 가열 블록 및 샘플을 냉각. 10 분 10,000 RPM에서 튜브를 원심 분리기. 펠렛 자료를 방해하지 않도록하는 유리 스크류 캡 튜브에 monosaccharide를 파생 매트릭스 다당류를 포함하는 산성 뜨는 100 UL을 전송. 펠렛은 (3을 참조하십시오.) 아래의 결정성 셀룰로오스 분석에 사용할 수 증발 장치의 공기의 부드러운 흐름에 따라 유리관에 TFA를 증발. 300 μl 2 – 프로파놀, 소용돌이를 추가하고 25 증발 ° C (세 번 총 반복) alditol 아세테이트 derivati​​zation 절차의 첫 번째 단계는 해당 alditols 수있는 단당류의 감소를 수행하는 것입니다. 이러한 목적으로 각 건조 시료에 나트륨 borohydride 솔루션 200 μl를 추가합니다. 신선한 해결책에게 1M 질산 수산화의 1ml 당 나트륨 borohydride의 10mg을 사용하여 각 시간을 준비합니다. 1.5 시간 동안 실온에서 유리관를 떠나 빙초산 150 UL 추가하여 솔루션을 중화 25 와동과 증발 ° C. 250 μl 초산 / 메탄올 (1시 9분, V / V), 소용돌이를 추가하고 25 증발 ˚ C (세 번 총 반복) 250 μl 메탄올을 추가하고, 공기의 흐름에 따라 증발 alditols의 아세틸화 들면, 아세트산 무수물 50 μl와 Pyrid 50 μl를 추가121 20 분 이네, 소용돌이 그리고 품어 ° 가열 블록의 C. 얼음 블록 시원하고 샘플 다운은 약 상온으로 온도 감소를 기다리는 동안. 상온에서 공기의 부드러운 흐름에 따라 시약을 증발. 주의 : alditol acetates는 매우 휘발성이 있습니다. 공기 아래에 200 μl 톨루엔을 추가하고 증발 (X3) 마지막 단계에서는 alditol acetates가 추출됩니다. 첫째, 에틸 아세테이트 및 가볍게 소용돌이 500 UL를 추가합니다. 이 물을 ML, 캡 튜브와 와동를 추가합니다. 맑은 별도의 레이어 (상단에 에틸 아세테이트, 바닥에 물)을 구하는 5 분 2,000 RPM에서 튜브를 원심 분리기 삽입과 GC / MS 유리병에 에틸 아세테이트 층의 피펫 50 UL. GC – 유리병과 뚜껑에 아세톤 100 UL을 추가하여 희석. 샘플 농도가 너무 높은 경우 샘플 볼륨 및 희석 볼륨은 GC / MS를 과부하 방지하기 조정할 수 있습니다. GC – 유리병 4 ° C가, GC / MS 분석을 즉시 진행되지 않는 경우에 저장할 수 있습니다 샘플은 quadrupole MS를 갖춘 GC에 주입하지만, 불꽃 이온화 검출기도 적합합니다. Supelco SP – 2380 (30mm X 0.25mm X 0.25 μm의 필름 두께) 컬럼 4min 용매 지연과 1.5ml/min의 유량과 함께 사용됩니다. 주입 샘플은 다음과 온도 프로그램에 들어서는 아르 : 160에서 초기 개최 ° 2 분 C, 20 ° 200 C / 분 램프 ° C 5 분 개최, 20 ° 245 C / 분 램프 ° C 유지 12 분, 270 스파이크 ° C와 160 ° C 2.26의 초기 온도까지 냉각하기 전에 5 분 기다) 봉우리가 표준 대량 프로필 및 / 또는 유지 시간에 의해 식별됩니다.. 단당류는 표준 곡선에 따라 계량입니다. 3. 결정 셀룰로오스 내용 이 방법은 기본적으로 Updegraf 8 시까지 설명되어 있습니다. 절연 세포 벽 재료 (1 참조) 또는 이미 2M TFA (2.8 참조) 중 남아있는 펠렛 즉시 산성 치료 후 (2.8 참조) 또는 TFA로 처리되어 벽의 재질 :이 절차를위한 시작 물질의 여러 가지가 있습니다 2 – 프로파놀, 말린과 함께 세탁되었습니다 펠릿. Updegraff 시약의 나사 덮인 유리관 1 ML (질산 : 물, 8시 1분 2초 V / V 초산)에서 TFA 펠렛에 추가합니다. 100 가열 블록에 밀접하게 캡 튜브, 소용돌이, 그리고 열 ° C 30 분. 이 치료의 결과로만 결정 셀룰로오스는 펠렛의 불용성 남아 있습니다. 객실 온도 또​​는 냉각기에 얼음 블록 시원하고 샘플 원심 분리기 샘플 15 분 10,000 rpm으로 펠렛이 없어야하고 제거 펠렛부터 물질이 아니라고 보장 뜨는 폐기하십시오. 이런 목적을 위해 약 두십시오. 튜브의 표면에 뜨는 150 UL. , 원심 분리기를 흔들, 물 1.5 ML를 추가하여 위의 완료로 뜨는 취소 아세톤 1.5 ML을 사용하여 프로 시저 추가 3 번 반복 세척 공기 건조 펠렛은 매우 부드럽게 공기 같이, 또는 야간 벤치에서 건조시킬 펠렛 (결정 셀룰로오스)는 Saeman 가수 분해라는 무엇에 의해 지금은 포도당으로 완전히 분해됩니다. 이러한 목적은 sarstedt 튜브에 175 μl 72%의 황산을 추가를위한 또 다른 15 분 30 분, 소용돌이 및 부화에 대한 실온에서 알을 품다 825 μl 물 소용돌이를 추가 5 분 10,000 RPM에서 샘플을 원심 분리기. 튜브에 남아 약간 갈색 불용성 물질, 리그닌이있을 수 있습니다. 뜨는의 포도당 내용은 colorimetric anthrone 분석을 사용하여 assayed입니다. 이 분석은 96 잘 폴리스티렌 microtiter 플레이트에서 수행됩니다. 표준 곡선은 1mg/ml 포도당 주식 (0 ° C에서 저장)을 사용하여 0, 2, 4, 6, 8, 10 UL을 pipetting하여 0, 2, 4, 6, 8, 10 UG 표준을 중복 작성을위한 별도의 적합한 우물에. 물을 각각 잘 최대 100 UL을 입력합니다. 별도의 셀에하지만 표준으로 동일한 microtiter 접시에 각 시료 표면에 뜨는 10 μl와 물 90 ML를 추가합니다. 신선한 Anthrone 시약 (Anthrone이 집중 황산, 2 MG anthrone / ML 황산에 용해) 200 μl를 추가 80 30 분 열 플레이트 오븐에 ° C (알루미늄 히트 스프 레더). 포도당이 포함된 샘플은 푸른 녹색으로 노란색에서 설정합니다. 룸 온도에 접시가 식지 철저하게 발라줍니다. microtiter 접시 리더를 사용하여 625mm에서 접시의 흡수를 참조하십시오. 포도당 (그리고 따라서 결정 셀룰로오스 함량)가 같은 접시에 설립 표준 곡선과 비교하여 흡광도를 기반으로 계산됩니다. 4. 대표 결과 벽 분석의 예제는 그림 2에 표시됩니다. 이 경우에는 포플러 줄기 (나무)은 프로토콜 섹션에서 설명한 여러 가지 절차에 의해 분석되었다. 매트릭스 POlysaccharide 구성이 식물 세포 벽에있는 전형적인 설탕 선물을 식별하는 예제 크로마토 그램으로 강조 표시됩니다, fucose, rhamnose, 자일로 오스, arabinose, 갈락토 오스, mannose와 포도당 (및 내부 표준 이노시톨). 높은 자일로 오스 함량에 의해 증명으로 포플러의 주요 hemicellulosic 구성 요소 크실란입니다. 그러나 이러한 당분의 풍부한는 공급 원료의 used4에 따라 달라집니다. 이 분석에서 포도당은 hemicellulose의 xyloglucan 및 비정질 셀룰로스에서 파생됩니다. 분석에 의한 데이터는 몰의 % 또는 UG / MG 벽 재​​료 (또는 건조 중량)로 제시하실 수 있습니다. 결정 셀룰로오스의 내용은 자체 설명이고, 하나는 벽 건조 무게의 20-50% 사이의 가치를 기대할 수 있습니다. 여기 부품 I3에 표시된 결과를 바탕으로 포플러 나무의 리그노셀룰로오스성 구성은 21 % 리그닌, 30 % hemicelluloses 및 41% 결정 셀룰로오스이다. 나머지 화산재 것입니다. 그림 1 :. 리그노셀룰로오스성 분석의 개요 세포 벽 (lignocellulosics)는 원유 건조 식물으로부터 격리됩니다. 벽 재료는 다음 aliquots에 가중치 및 다양한 assays에 대한 세분화됩니다. 매트릭스 다당류 성분은 약한 산성 (2M TFA)와 벽에 자료를 치료 자신의 alditol acetates하는 결과 solubilized 단당류를 derivati​​zing하고, GC – MS에 의해 분석 후에 설정됩니다. 약한 산성 치료의 잔여물은 소위 Updegraff 시약은 뒤에서만 불용성 crystlline의 셀룰로오스를 떠나지로 세탁합니다. 셀룰로오스는 황산에 의해 solubilized 및 포도당 내용을 결정하는 colorimetric 분석하여 계량입니다. 부 3에서 설명한대로 병렬로, 리그닌의 내용과 구성이 결정하실 수 있습니다. 그림 2 :. 포플러 (포풀러스 tremoloides)에서 포플러 나무 종합 리그노셀룰로오스성 분석 우드 칩은 설명 프로토콜에 받게되었습니다. 왼쪽 상단 : 매트릭스 다당류 성분, Fuc fucose, rhamnose Rha, 아라 arabinose, Xyl 자일로 오스, 남자 mannose, 걸 갈락토 오스, Glc 포도당, 이노시톨 내부 기준.

Discussion

설명 방법 리그노셀룰로오스성 식물 바이오 매스의 구성의 급속한 양적 평가를 가능하게합니다. 방법은 즉 매트릭스 다당류 hemicelluloses의 설탕 구성, 결정 셀룰로오스 내용을 포함하여 같은 물질의 조성의 결정 수 있습니다. 인당 다양한 분석 방법의 처리량이 다릅니다. 여기에서 설명한 프로토콜을 사용하여, 20 샘플이 결정 셀룰로오스 내용에 대한 매트릭스 다당류의 성분과 30 처리할 수 있습니다. 데이터 최적의 공급 원료 작물의 양적 특성으로 인해, 다양한이나 genotypes는 생물 연료 생산을위한 그들의 적합성의 관점에서 평가하실 수 있습니다.

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Trifluoroacetic acid		Sigma-Aldrich	T6508
myo-Inositol		Sigma-Aldrich	I5125
Sodium Borohydride		Sigma-Aldrich	213462
Pyridine		J.T. Baker	3348-01
Acetic Anhydride		Sigma-Aldrich	320102
Spectromax Plus 384		Molecular Devices	Plus384
GC-MS		Agilent	7890A GC/5975C MSD
5.5mm Stainless Steel Balls		Salem Ball Company	(N/A)
96 well plate heat spreader		Biocision	Coolsink 96F
Retsch Mill		Qiagen	TissueLyser II
Heating block		Techne	Dri-block DB-3D
Sample concentrator		Techne	FSC400D