Purificazione della M. magneticum Strain AMB-1 proteina Magnetosome Associated MamAΔ41
Summary
Mama è un unico Magnetosome proteina associata che ha dimostrato di essere coinvolti nella attivazione magnetosome. Qui vi presentiamo il protocollo di purificazione di Mama cancellazione mutante (MamAΔ41) da<em> M. magneticum</em> AMB-1.
Abstract
Batteri magnetotactic comprendono un gruppo eterogeneo di microrganismi acquatici che sono in grado di orientarsi lungo i campi geomagnetici. Questo comportamento è creduto per aiutare la loro ricerca di ambienti adatti<em> (1)</em>. Questa capacità è conferita dal magnetosome, un organello subcellulare che consiste in una catena di montaggio lineare di vescicole lipidiche ognuno in grado di biomineralize e allegare una 50-nm ~ cristallo di magnetite o greigite. Un componente principio della magnetosome che ha dimostrato di essere necessario per la formazione di vescicole funzionale è mamma. Mama è una grande abbondanza magnetosome proteina associata, che è uno dei più caratterizzato magnetosome proteine associate<em> In vivo</em><em> (2-6)</em>. Questo articolo si concentra sulla purificazione della mamma, che nonostante in fase di studio<em> In vivo</em>, Nessun dettaglio chiara funzionale o strutturale sono stati identificati per questo. Bioinformatica analisi ha suggerito che la mamma è una tetra-tricopeptide ripetizione (TPR) contenente proteine. TPR è un motivo strutturale trovato come parte o formazione di una piega più grande in una vasta gamma di proteine, serve come modello per interazioni proteina-proteina e media multi-proteina complessi<em> (7)</em>. TPRs sono coinvolti in molte attività cruciali nei processi eucariotiche organello cellulare e molti percorsi batterica<em> (8-14).</em> Per capire la mamma, un TPR unico contenente proteine, proteine altamente purificate è necessario, come primo passo. In questo articolo presentiamo il protocollo di purificazione di una stalla Mama cancellazione mutante (MamAΔ41) da<em> M. magneticum</em> AMB-1.
Protocol
Discussion
Purificazione di proteine è il passo principale in qualsiasi biochimica delle proteine o studi strutturali. Dato che ogni proteina è unico, con il proprio comportamento, si ha la necessità di definire le sue proprietà e modificare di conseguenza la sua purificazione. Obiettivo di proteine deve essere analizzato come un primo passo verso la purificazione mediante strumenti bioinformatici. Sono utilizzati per calcolare la iso-elettrico punto di destinazione, valutare la sua necessità di ridurre / os…
Acknowledgements
Noi riconosciamo il dottor Amir Aharoni per il suo sostegno e Gheula Davidov, Noam Grimberg e Chen Guttman per i loro consigli e commenti.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| French Press | Equipment | Thermo scientific | FA-078A | |
| Pressure cell | Equipment | Thermo scientific | FA-032 | |
| Ultra-centrifuge | Equipment | Sorvall | Discovery 90SE | |
| Rottor | Equipment | Beckman | Ti60 | |
| Ultra-centrifuge tubes; PC-Bottle+Cap Assay 26.3ml | Equipment | Beckman | BC-355618 | |
| 2.5cm diameter, Glass Econo-Column Chromatography Columns | Equipment | BioRad | 737-2521 | |
| Ni-NTA His Bind resin | Equipment | Novagen | M0063428 | |
| Spectrophotometer | Equipment | Amersham Biosiences | Ultraspec 2100 pro | |
| Quartz cuvette | Equipment | Hellma | 104-QS | |
| Fast Performance Liquid Chromatography- AKTA purifier 10 | Equipment | GE Healthcare Biosciences | 28-4062-64 | |
| Ion exchange column – MonoQ 4.6/100 PE | Equipment | GE Healthcare Biosciences | 10025543 | |
| Size exclusion pre-packed column-HiLoad 26/60 Superdex 200 | Equipment | GE Healthcare Biosciences | 17-1071-01 | |
| Centricon – Vivaspin15 – 10,000 MWCO | Equipment | Sartorius Stedim Biotech GmbH | VS1501 | |
| Table centrifuge | Equipment | Thermo scientific | IEC CL30R | |
| MALDI-TOF | Equipment | Bruker Daltonics | Reflex IV | |
| Tris-HCl (hydrotymethyl) aminomethane | Reagent | BioLab | 20092391 | |
| Sodium Chloride | Reagent | FRUTROM | 235553470 | |
| Imidazole | Reagent | Alfa Aesar | 288-32-4 | |
| EDTA free protease inhibitors cocktail | Reagent | Sigma | P-8849 | |
| Dnase I (Deoxyribonuclease I) | Reagent | Sigma | DN-25 | |
| Bovine Thrombin | Reagent | Fisher BioReagents | BP25432 | |
| Glycine | Reagent | BioLab | 07132391 | |
| Soudim Dodecyl Sulfate (SDS) | Reagent | BioLab | 19822391 | |
| Beta-mercaptoethanol | Reagent | Sigma | M-3148 | |
| InstantBlue | Reagent | Expedeon | 1SB01L | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | Reagent | Fermentas | SM0671 |
Riferimenti
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