La purificación de la M. magneticum Tensión AMB-1 magnetosomas proteína asociada MamAΔ41
Summary
Mamá es una única proteína magnetosomas asociados, que ha demostrado ser involucrados en la activación de magnetosomas. Aquí se presenta el protocolo de purificación de Mama supresión mutante (MamAΔ41) de<em> M. magneticum</em> AMB-1.
Abstract
Las bacterias magnetotácticas comprenden un grupo heterogéneo de microorganismos acuáticos que son capaces de orientarse a lo largo de los campos geomagnéticos. Este comportamiento se cree para ayudar a su búsqueda de ambientes adecuados<em> (1)</em>. Esta capacidad es conferido por la magnetosomas, un orgánulo subcelular que consta de un conjunto de cadena lineal de las vesículas de lípidos cada uno capaz de biomineralize y adjuntar un ~ 50 nm de cristales de magnetita o greigite. Un componente principal de la magnetosomas que ha demostrado ser necesarios para la formación de vesículas funcional es mamá. Mamá es una muy abundante magnetosomas proteína asociada a que es uno de los más caracterizados magnetosomas proteínas asociadas<em> In vivo</em><em> (2-6)</em>. Este artículo se centra en la purificación de la mamá, que a pesar de ser estudiado<em> In vivo</em>, No hay detalles funcionales o estructurales han sido identificados por él. Bioinformática análisis sugiere que mamá es una repetición de tetra-tricopeptide (TPR), que contiene proteínas. TPR es un motivo estructural encontrado como parte o formación de un pliegue más importante en un amplio rango de proteínas, sirve como un modelo para las interacciones proteína-proteína y proteína interviene en varios complejos<em> (7)</em>. EPC están implicados en muchas tareas cruciales en la célula eucariota procesos orgánulo y muchas vías de bacterias<em> (8-14).</em> Para entender Mama, a TPR única que contiene la proteína, la proteína altamente purificada se requiere como un primer paso. En este artículo se presenta el protocolo de purificación de un mutante estable Mama eliminación (MamAΔ41) de<em> M. magneticum</em> AMB-1.
Protocol
Discussion
Purificación de proteínas es el paso principal en todas las proteínas bioquímicos o estudios estructurales. Dado que cada proteína es única con su propio comportamiento, es necesario definir sus propiedades y modificar en consecuencia su purificación. Blanco de la proteína debe ser analizado como un primer paso hacia la purificación usando herramientas bioinformáticas. Que se utilizan para calcular el objetivo de punto isoeléctrico, evaluar su necesidad de la reducción / oxidación medio ambiente y su necesi…
Acknowledgements
Reconocemos el Dr. Amir Aharoni por su apoyo y Geula Davidov, Grimberg Noam y Guttman Chen por sus consejos y comentarios.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| French Press | Equipment | Thermo scientific | FA-078A | |
| Pressure cell | Equipment | Thermo scientific | FA-032 | |
| Ultra-centrifuge | Equipment | Sorvall | Discovery 90SE | |
| Rottor | Equipment | Beckman | Ti60 | |
| Ultra-centrifuge tubes; PC-Bottle+Cap Assay 26.3ml | Equipment | Beckman | BC-355618 | |
| 2.5cm diameter, Glass Econo-Column Chromatography Columns | Equipment | BioRad | 737-2521 | |
| Ni-NTA His Bind resin | Equipment | Novagen | M0063428 | |
| Spectrophotometer | Equipment | Amersham Biosiences | Ultraspec 2100 pro | |
| Quartz cuvette | Equipment | Hellma | 104-QS | |
| Fast Performance Liquid Chromatography- AKTA purifier 10 | Equipment | GE Healthcare Biosciences | 28-4062-64 | |
| Ion exchange column – MonoQ 4.6/100 PE | Equipment | GE Healthcare Biosciences | 10025543 | |
| Size exclusion pre-packed column-HiLoad 26/60 Superdex 200 | Equipment | GE Healthcare Biosciences | 17-1071-01 | |
| Centricon – Vivaspin15 – 10,000 MWCO | Equipment | Sartorius Stedim Biotech GmbH | VS1501 | |
| Table centrifuge | Equipment | Thermo scientific | IEC CL30R | |
| MALDI-TOF | Equipment | Bruker Daltonics | Reflex IV | |
| Tris-HCl (hydrotymethyl) aminomethane | Reagent | BioLab | 20092391 | |
| Sodium Chloride | Reagent | FRUTROM | 235553470 | |
| Imidazole | Reagent | Alfa Aesar | 288-32-4 | |
| EDTA free protease inhibitors cocktail | Reagent | Sigma | P-8849 | |
| Dnase I (Deoxyribonuclease I) | Reagent | Sigma | DN-25 | |
| Bovine Thrombin | Reagent | Fisher BioReagents | BP25432 | |
| Glycine | Reagent | BioLab | 07132391 | |
| Soudim Dodecyl Sulfate (SDS) | Reagent | BioLab | 19822391 | |
| Beta-mercaptoethanol | Reagent | Sigma | M-3148 | |
| InstantBlue | Reagent | Expedeon | 1SB01L | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | Reagent | Fermentas | SM0671 |
Riferimenti
- Faivre, D., Schuler, D. Magnetotactic Bacteria and Magnetosomes. Chem Rev. 108, 4875-4898 (2008).
- D’Andrea, L. D., Regan, L. TPR proteins: the versatile helix. Trends Biochem Sci. 28, 655-662 (2003).
- Young, J. C., Barral, J. M., Hartl, U. l. r. i. c. h., F, . More than folding: localized functions of cytosolic chaperones. Trends Biochem Sci. 28, 541-547 (2003).
- Brocard, C., Hartig, A. Peroxisome targeting signal 1: is it really a simple tripeptide?. Biochim Biophys Acta. 1763, 1565-1573 (2006).
- Fransen, M., Amery, L., Hartig, A., Brees, C., Rabijns, A., Mannaerts, G. P., Van Veldhoven, P. P. Comparison of the PTS1- and Rab8b-binding properties of Pex5p and Pex5Rp/TRIP8b. Biochim Biophys Acta. 1783, 864-873 (2008).
- Baker, M. J., Frazier, A. E., Gulbis, J. M., Ryan, M. T. Mitochondrial protein-import machinery: correlating structure with function. Trends Cell Biol. 17, 456-464 (2007).
- Mirus, O., Bionda, T., von Haeseler, A., Schleiff, E. Evolutionarily evolved discriminators in the 3-TPR domain of the Toc64 family involved in protein translocation at the outer membrane of chloroplasts and mitochondria. J Mol Model. 15, 971-982 (2009).
- Gatsos, X., Perry, A. J., Anwari, K., Dolezal, P., Wolynec, P. P., Likic, V. A., Purcell, A. W., Buchanan, S. K., Lithgow, T. Protein secretion and outer membrane assembly in Alphaproteobacteria. FEMS Microbiol Rev. 32, 995-1009 (2008).
- Tiwari, D., Singh, R. K., Goswami, K., Verma, S. K., Prakash, B., Nandicoori, V. K. Key residues in Mycobacterium tuberculosis protein kinase G play a role in regulating kinase activity and survival in the host. J Biol Chem. 284, 27467-27479 (2009).
- Edqvist, P. J., Broms, J. E., Betts, H. J., Forsberg, A., Pallen, M. J., Francis, M. S. Tetratricopeptide repeats in the type III secretion chaperone, LcrH: their role in substrate binding and secretion. Mol Microbiol. 59, 31-44 (2006).
- Grunberg, K., Muller, E. C., Otto, A., Reszka, R., Linder, D., Kube, M., Reinhardt, R., Schuler, D. Biochemical and proteomic analysis of the magnetosome membrane in Magnetospirillum gryphiswaldense. Appl Environ Microbiol. 70, 1040-1050 (2004).
- Komeili, A., Vali, H., Beveridge, T. J., Newman, D. K. Magnetosome vesicles are present before magnetite formation, and MamA is required for their activation. Proc Natl Acad Sci USA. 101, 3839-3843 (2004).
- Okuda, Y., Fukumori, Y. Expression and characterization of a magnetosome-associated protein, TPR-containing MAM22, in Escherichia coli. FEBS Lett. 491, 169-173 (2001).
- Taoka, A., Asada, R., Sasaki, H., Anzawa, K., Wu, L. F., Fukumori, Y. Spatial localizations of Mam22 and Mam12 in the magnetosomes of Magnetospirillum magnetotacticum. J Bacteriol. 188, 3805-3812 (2006).
- Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expression and Purification. 41, 207-234 (2005).
