评估电子晶体结构生物学研究的小膜蛋白的二维结晶试验
Summary
形成有序的膜蛋白质阵列的二维（2D）的结晶试验评价是一个非常关键的电子晶体而艰巨的任务。在这里，我们描述了我们的方法，筛选，并确定在15范围内的主要是小膜蛋白的二维晶体 – 90kDa。
Abstract
电子晶体学已经发展成为一个可以交替使用，也可以结合三维结晶和X射线晶体学研究膜蛋白的结构与功能的问题，以及可溶性蛋白的方法。二维（2D）晶体透射电子显微镜（EM）的筛查是在寻找关键的一步，优化，并选择冷冻电镜的高分辨率数据采集的样品。在这里，我们描述了大型和排序，以及小型二维数组，可以潜在的结晶条件的优化提供重要的信息在确定的基本步骤。
通过不同放大倍数的EM，在一系列关键参数的获取数据。下放大倍率上的形态和膜大小提供了宝贵的数据。在更高的放大倍率，确定可能的秩序和二维晶体的尺寸。在这种情况下，它是描述CCD相机和在线傅立叶变换是如何在更高的放大倍率用于评估顺序和大小proteoliposomes。
虽然膜蛋白的二维晶体，是最常用的透析重建的速度增长，筛选技术也同样适用于单层，帮助本地的二维晶体生产晶体，并下令可溶性蛋白质阵列。此外，这里介绍的方法适用于二维晶体更小，以及较大的膜蛋白，其中较小的蛋白质需要在识别相同数量的护理我们的例子中，较大的蛋白质晶格的筛选，可能会更容易识别在早期阶段的筛选。
Protocol
Discussion
样品进行适当的评价，需要认真评估的足够数量的膜。例如，低至2％的晶体阵列成像proteoliposomes超过180的样品给了二维结晶条件的快速优化的关键信息。
蛋白质沉淀发生时，一个网格可能被放弃进一步的筛选后，在低倍率的检查，虽然偶尔出现部分沉淀的蛋白质。即使很小小于100 nm的膜虽然可以给有关订单的有用信息，并增加二维晶体大小的参数，可以在以下透析实验实施?…
Acknowledgements
我们感谢我们的合作者提供了宝贵的蛋白质样品，这有助于我们的方法相关的经验和观察一些。德博Schmalzing好心提供了机会，为fr加入这个项目。芭芭拉Armbruster，雅各Brink和德里克米尔斯是他们的杰出的帮助和设备上的投入表示感谢。经费是由美国国立卫生研究院授予HL090630。
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 400-mesh copper TEM grids coated with carbon film | ||||
| forceps: regular and anti-capillary | Dumont #5 and Dumont N5AC or similar | |||
| Micropipette and pipette tips | ||||
| Whatman #4 filter paper | ||||
| 1% uranyl acetate | ||||
| Dialysis sample to be screened for 2D crystals | ||||
| Glycerol/sucrose-free dialysis buffer | Optional | |||
| JEOL-1400 transmission electron microscope (TEM) | similar 80 – 120kV TEM equipped with an Lab6 or tungsten filament and film and/or CCD cameras (Gatan Orius SC1000 and/or UltraScan1000 CCD cameras and Gatan Digitial Micrograph software package or Tietz cameras (TVIPS)) |
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