Análisis de la elaboración de un fenotipo morfológico en función de la concentración de proteínas en la levadura en ciernes
Summary
Deleción del gen y la sobreexpresión de la proteína son métodos comunes para el estudio de las funciones de las proteínas. En este artículo se describe un protocolo para el análisis del fenotipo de desarrollo en función de la concentración de proteínas en la población y de una sola célula en los niveles<em> Saccharomyces cerevisiae</em>.
Abstract
Deleción del gen y la sobreexpresión de la proteína son métodos comunes para el estudio de las funciones de las proteínas. En este artículo se describe un protocolo para el análisis del fenotipo de desarrollo en función de la concentración de proteínas en la población y de una sola célula en los niveles<em> Saccharomyces cerevisiae</em>. Aunque este protocolo se basa en la sobre-expresión de una proteína, que puede ser fácilmente adaptado a fenotipos morfológicos dependientes de la supresión de la expresión de la proteína. Nuestro laboratorio está interesado en estudiar las propiedades de señalización de la proteína epsin adaptador endocítica. Para tal fin se utilizó un enfoque negativo dominante en el que sobre-expresa la conservación<u> E</u> PSIN<u> N</u> -<u> T</u> Erminal<u> H</u> Omology (Enth) de dominio con el fin de interferir con las funciones de la endógena epsin-2 (Ent2 o YLR206W). Hemos observado que la sobreexpresión del dominio Enth de Ent2 (ENTH2) en células de tipo salvaje llevó a un defecto de la división celular que depende de la deslocalización de una familia de proteínas de andamiaje, septins.
Protocol
Discussion
Este protocolo describe la manera de supervisar el desarrollo de un fenotipo morfológico (célula de levadura no pueden someterse a la división celular adecuada) a sobreexpresión de la proteína. Cuando se realiza este procedimiento, es importante recordar que la cosecha de células de levadura por granulación a la velocidad de centrifugado se recomienda como una mayor velocidad puede dañar las células y los resultados oscuro. El azul de metileno y el blanco calcofluor debe agregarse a las células vivas justo ant…
Acknowledgements
Damos las gracias a Brian G. Coon y Claudia B. Hanna útil para los debates y el apoyo. Este proyecto fue financiado por los fondos iniciales de la Dip. de Ciencias Biológicas de la Universidad de Purdue a Claudio R. Aguilar y una subvención de la American Cancer Society Institucional de Investigación de Claudio R. Aguilar a través del Centro de Cáncer de Purdue.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Nocodazole | Reagent | Sigma (St. Louis, MO) | M1404 | |
| Methylene Blue 1% (w/v) | Reagent | VWR International | VW6276-0 | |
| Calcofluor White | Reagent | Sigma (St. Louis, MO) | F3543 | |
| Petroleum Jelly | Reagent | VWR International | VW3339-2 |
Riferimenti
- Rönicke, V., Graulich, W., Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. Use of conditional promoters for expression of heterologous proteins in Saccharomyces cerevisiae. Methods Enzymol. 283, 313-322 (1997).
- Gietz, R. D., Woods, R. A. . High efficiency transformation with lithium acetate in Molecular Genetics of Yeast: A Practical Approach. , 121-134 (1994).
- Mukherjee, D., Coon, B. G., Edwards, D. F., Hanna, C. B., Longhi, S. A., McCaffery, J. M., Wendland, B., Retegui, L. A., Bi, E., Aguilar, R. C. The yeast endocytic protein Epsin 2 functions in a cell-division signaling pathway. J Cell Sci. 122, 2453-2463 (2009).
- Sherman, F. . Getting started with yeast in Guide to Yeats genetics and Molecular Biology. , 3-21 (1991).
