Dissecção do Organizador e Explantes Pólo animal a partir de embriões Xenopus laevis e Montagem de um ensaio de Adesão Celular

Summary

Este vídeo demonstra a técnica utilizada para a preparação de organizador e explantes pólo animal a partir de embriões Xenopus laevis, incluindo o uso da faca sobrancelha – uma ferramenta de dissecção especializados feitos da própria sobrancelha. O protocolo para a montagem de um ensaio de aderência também é dado, que investiga para a presença de moléculas de adesão chave presentes na superfície ou organizador de células animais pólo que são críticos para o desenvolvimento adequado.

Protocol

Preparando Chambers Adesão (um dia antes da injecção / dissecção) Ensaio de aderência Chambers Se você tem um microscópio composto convencional (óptico localiza acima do palco), é ncecessary para fazer uma baixa altura câmara de adesão da seguinte forma. Se estiver usando o microscópio invertido óptica, então "NUNC Lab-Tek lamela Chambered" pode apenas ser usado, e ignore as etapas # 1 – 2. Anexar um dos "press-to-vedação i…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
1x MBS-H	Buffer			Modified Barth’s medium: 1L recipe 5.14g NaCl 75mg KCl 0.2g NaHCO3 0.2g MgSO4•7H2O 60mg CaCl2•2H2O 80mg Ca(NO3)2•4H2O 2.38g HEPES, free-acid Adjust the pH to 7.4 with NaOH. Autoclave.
CMF-MBS	Buffer			This is Ca2+/Mg2+-free version of MBS-H. 500ml recipe : 2.57g NaCl 37.5mg KCl 0.1g NaHCO3 1.19g HEPES, free-acid Adjust the pH to 7.4 with NaOH. Autoclave.
1% agarose/1x Barth’s plates				as many as the number of samples
1% agarose/CMF-MBS plates				as many as the number of samples
E-Cadherin/Fc chimera	Reagent	Sigma	E-2278	Dissolve 0.1mg of solid E-cadherin in 100ul of 1x MBS-H containing 40% glycerol to make 100x master stock (1.0mg/ml). Store it in –20C. Make 1/100 dilution with 1x MBS-H to make 10ug/ml working solution just before you use. You need 200ul per samples of this working solution.
Fibronectin, 0.1% solution	Reagent	Sigma	F-1141	This pre-made solution can be used as 50x stock. Make 1/50 dilution with 1x MBS-H make 20ug/ml working solution just before you use. You need 200ul per samples of this working solution. I do NOT recommend using solid Fibronectin, because it is difficult to dissolve at 0.1% concentration to make the stock solution. Although it is more expensive, this pre-made 0.1% solution is better to obtain consistent results.
4% BSA /MBS-H	Buffer			BSA: molecular biology grade fraction V
Sigmacoted yellow tips	Tool
No.1 cover slips				40x24mm or 60x24mm
Press-to-seal silicon insulator	Tool	Glace Bio-Labs	JTR20-2.5	2.5mm depth x 20mm diameter
NUNC Lab-Tek Chambered Coverglass	Tool	Fisher	12-565-471	2wells/slides
Grid slide glass	Tool			or Finder graticule for cell counting