Die Anwendung der Stopped-Flow-Kinetics Methoden der Wirkmechanismus eines DNA-Repair Protein Untersuchen
Summary
MSH2-MSH6 ist verantwortlich für die Initiierung Reparatur der Replikation Fehler bei der DNA. Hier präsentieren wir eine transiente Kinetik Ansatz zum Verständnis, wie diese kritische Protein funktioniert. Der Bericht zeigt, stopped-flow Experimente zur Messung der gekoppelten DNA-Bindung und ATPase-Kinetik zugrunde liegenden MSH2-MSH6 Wirkmechanismus in der DNA-Reparatur.
Abstract
Transient kinetische Analyse ist für das Verständnis der Funktionsweise von biologischen Makromolekülen unverzichtbar, da dieser Ansatz liefert mechanistische Informationen einschließlich der aktiven Seite Konzentrationen und intrinsischen Geschwindigkeitskonstanten, die makromolekulare Funktion zu regieren. Im Falle von Enzymen, z. B. zu identifizieren vorübergehend oder pre-steady state Messungen und Charakterisierung von einzelnen Veranstaltungen in den Reaktionsweg, während steady state Messungen nur Gesamtausbeute katalytische Effizienz und Spezifität. Einzelne Ereignisse wie Protein-Protein-oder Protein-Ligand-Wechselwirkungen und geschwindigkeitsbestimmenden Konformationsänderungen treten häufig in den Millisekundenbereich und kann direkt durch Stopped-Flow-und chemisch-Quench-Flow-Verfahren gemessen werden. Da ein optisches Signal, wie Fluoreszenz, stopped-flow dient als leistungsfähige und leicht zugängliche Tool zur Überwachung Reaktion Fortschritt von Substratbindung an Produkt-Release und katalytische Umsatz 1,2.
Hier berichten wir über Anwendung der Stopped-Flow-Kinetik der Wirkmechanismus von MSH2-MSH6, einer eukaryotischen DNA-Reparatur-Protein, das Basenpaar-Fehlpaarungen und Einfügen / Löschen Schleifen in DNA und Signale Mismatch-Reparatur (MMR) 3-5 erkennt Sonde. Dabei hilft MSH2-MSH6 erhöht die Genauigkeit der DNA-Replikation von drei Größenordnungen (Fehlerhäufigkeit sinkt von ~ 10 -6 bis 10 -9 Basen) und damit zu bewahren genomischen Integrität. Es überrascht nicht, ist defekt menschlichen MSH2-MSH6 Funktion mit hereditären nicht-polypösen Darmkrebs und anderen Krebsarten sporadisch 6-8 verbunden. Um den Wirkmechanismus dieser kritischen DNA metabolischen Protein zu verstehen, sind wir die Erforschung der Dynamik der MSH2-MSH6 Interaktion mit nicht übereinstimmenden DNA sowie die ATPase-Aktivität, die Kraftstoffe seine Aktionen in MMR. T mismatch und Überwachung der daraus resultierende Anstieg in 2-Amino-Fluoreszenz in Echtzeit: DNA-Bindung wird durch rasches Mischen MSH2-MSH6 mit DNA mit einem 2-Amino (2-Ap) Fluorophor benachbart zu einem G gemessen. T (2-Ap) Mismatch-Komplex mit unmarkierten Falle DNA und Überwachung Abnahme der Fluoreszenz im Laufe der Zeit 9: DNA Dissoziation wird durch Mischen von vorgeformten MSH2-MSH6 G gemessen. Pre-Steady-State-ATPase Kinetik werden durch die Veränderung der Fluoreszenz von 7-Diethylamino-3-((((2-maleimidyl) ethyl) amino) carbonyl) Cumarin)-markiertem Phosphat Binding Protein (MDCC-PBP) auf Bindung von Phosphat (gemessen Pi) von MSH2-MSH6 folgenden ATP-Hydrolyse 9,10 freigegeben.
Die Daten zeigen eine schnelle Bindung von MSH2-MSH6 eine G: T Mismatch und die Bildung eines langlebigen MSH2-MSH6 G: T-Komplex, was wiederum zu einer Unterdrückung der ATP-Hydrolyse und die Stabilisierung des Proteins in einem ATP-gebundenen Form . Die Reaktionskinetik klare Unterstützung für die Hypothese, dass ATP-gebundenen MSH2-MSH6 Signale DNA-Reparatur auf die Bindung einer unpassenden Basenpaar in der Doppelhelix.
F. Noah Biro und Jie Zhai trugen zu diesem Papier ebenso.
Protocol
Discussion
Das Beispiel eines DNA-Mismatch-binding protein hier beschriebenen veranschaulicht die Leistungsfähigkeit und den Nutzen von transient kinetische Methoden zur Erforschung der Mechanismen von biologischen Molekülen. Stopped-Flow-Messungen an den einzelnen Umsatz Zeitskala der eindeutige Beweis für eine schnelle und spezifische Bindung von MSH2-MSH6 Protein zu einem übereinstimmenden Basenpaar und die Bildung eines langlebigen Protein X DNA-Komplex in der Reaktion 9. Des Weiteren hat die Stopped-Flow-(und Q…
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch einen NSF CAREER Award (MMH), ein Barry M. Goldwater Stipendium (FNB) und eine ASBMB Undergraduate Research Award (CWD) unterstützt. Der Klon für die Überexpression von PBP wurde freundlicherweise von Dr. Martin Webb (MRC, UK) zur Verfügung gestellt.
Materials
| DNA name | Sequence |
| 37 G | 5′- ATT TCC TTC AGC AGA TAT G T A CCA TAC TGA TTC ACA T -3′ |
| 37 T (2-Ap) | 5′- ATG TGA ATC AGT ATG GTA TApT ATC TGC TGA AGG AAA T -3′ |
| 37 T | 5′- ATG TGA ATC AGT ATG GTA T A T ATC TGC TGA AGG AAA T -3′ |
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