Aplicación de métodos de flujo detenido Cinética para investigar el mecanismo de acción de una proteína de reparación del ADN
Summary
MSH2, MSH6 es responsable de iniciar la reparación de errores de replicación del ADN. Aquí se presenta un enfoque cinética transitoria hacia la comprensión de cómo funciona esta proteína crítica. El informe pone de manifiesto de flujo detenido experimentos para medir la unión de ADN, acoplado y la cinética de la ATPasa subyacente MSH2, MSH6 mecanismo de acción de reparación del ADN.
Abstract
Análisis de la cinética transitoria es indispensable para entender el funcionamiento de las macromoléculas biológicas, ya que este método proporciona información mecanicista, incluidas las concentraciones del sitio activo y constantes intrínsecas que rigen la función tasa de macromoléculas. En el caso de las enzimas, por ejemplo, las mediciones de estado transitorio o constante pre-identificar y caracterizar los eventos individuales en el camino de reacción, mientras que las mediciones en estado estacionario sólo el rendimiento eficiencia global catalítica y la especificidad. Eventos individuales como las interacciones proteína-proteína o proteína-ligando y la limitación de la velocidad a menudo se producen cambios conformacionales en la escala de tiempo de milisegundos, y se puede medir directamente por flujo detenido y productos químicos apagar los métodos de flujo. Dada una señal óptica, tales como la fluorescencia, se detuvo el flujo sirve como una herramienta poderosa y accesible para el seguimiento de la reacción de la unión del sustrato para liberar el producto y el volumen de negocios 1,2 catalítico.
En este sentido, el informe de aplicación de la cinética de flujo detenido para investigar el mecanismo de acción de MSH2, MSH6, una proteína de reparación del ADN eucariota que reconoce pares de bases y los desajustes de inserción / deleción bucles en el ADN y la reparación de las señales de desequilibrio (MMR) 3-5. De este modo, MSH2, MSH6 aumenta la precisión de la replicación del ADN por tres órdenes de magnitud (frecuencia de errores disminuye a partir de ~ 10 -6 a 10 -9 bases), y por lo tanto ayuda a preservar la integridad genómica. No es de extrañar, defectos humanos MSH2, MSH6 función está asociada con el cáncer de colon hereditario no polipósico y otros cánceres esporádicos 6-8. A fin de comprender el mecanismo de acción de esta proteína ADN metabólica fundamental, que están investigando la dinámica de MSH2, MSH6 interacción con el ADN no coinciden, así como la actividad de la ATPasa de que los combustibles de sus acciones en la MMR. De unión al ADN se mide por la rápida mezcla MSH2, MSH6 con el ADN que contiene un 2-aminopurine (2-Ap) fluoróforo al lado de un G: T desajustes y el control de la consiguiente aumento de la fluorescencia de 2-aminopurine en tiempo real. ADN disociación se mide mediante la mezcla de pre-formado MSH2, MSH6 G: T (2-Ap) complejo de falta de coincidencia con el ADN trampa sin etiquetar y disminuir el control de la fluorescencia en el tiempo 9. Pre-ATPasa constante cinética de estado se mide por la variación en la fluorescencia de 7-dietilamino-3-((((2-maleimidyl) etil) amino) carbonil) cumarina)-etiquetados proteínas de unión a fosfato (MDCC-PBP) de fosfato de unión ( Pi), publicado por MSH2, MSH6 después de la hidrólisis de ATP 9,10.
Los datos revelan una rápida unión de MSH2, MSH6 a un G: no coincide el T y la formación de una larga vida MSH2, MSH6 G: T complejo, que a su vez se traduce en la supresión de la hidrólisis de ATP y la estabilización de la proteína en forma de ATP obligado . La cinética de la reacción proporcionan un claro apoyo a la hipótesis de que la ATP con destino MSH2, MSH6 señales de reparación del ADN en el enlace de un par de bases no coinciden en la doble hélice.
F. Noé Biro y Zhai Jie contribuido a este trabajo por igual.
Protocol
Discussion
El ejemplo de una proteína de unión al ADN desajuste se describe aquí se muestra la eficacia y utilidad de los métodos cinéticos transitoria para el estudio de los mecanismos de las moléculas biológicas. Mediciones de flujo detenido en la escala de tiempo de rotación único previsto una evidencia inequívoca de la unión rápida y específica de la proteína MSH2, MSH6 a un par de bases coincidentes y la formación de un complejo de ADN de larga duración proteína X en la reacción 9. Por otra parte,…
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por un premio CARRERA NSF (MMH), un Barry M. Goldwater de becas (FNB) y un Premio de Investigación de Pregrado ASBMB (CWD). El clon de la sobre-expresión de PBP fue proporcionado amablemente por el Dr. Martin Webb (MRC, Reino Unido).
Materials
| DNA name | Sequence |
| 37 G | 5′- ATT TCC TTC AGC AGA TAT G T A CCA TAC TGA TTC ACA T -3′ |
| 37 T (2-Ap) | 5′- ATG TGA ATC AGT ATG GTA TApT ATC TGC TGA AGG AAA T -3′ |
| 37 T | 5′- ATG TGA ATC AGT ATG GTA T A T ATC TGC TGA AGG AAA T -3′ |
Riferimenti
- Johnson, K. A. Advances in transient-state kinetics. Curr Opin Biotechnol. 9 (1), 87-89 (1998).
- Johnson, K. A. E. . Kinetic analysis of macromolecules. , (2003).
- Obmolova, G., Ban, C., Hsieh, P., Yang, W. Crystal structures of mismatch repair protein MutS and its complex with a substrate DNA. Nature. 407 (6805), 703-710 (2000).
- Lamers, M. H. The crystal structure of DNA mismatch repair protein MutS binding to a G x T mismatch. Nature. 407 (6805), 711-717 (2000).
- Warren, J. J. Structure of the human MutSalpha DNA lesion recognition complex. Mol Cell. 26 (4), 579-592 (2007).
- Kunkel, T. A. &. a. m. p. ;. a. m. p., Erie, D. A. . DNA Mismatch Repair. Annu Rev Biochem. 74, 681-710 (2005).
- Jiricny, J. The multifaceted mismatch-repair system. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (5), 335-346 (2006).
- Hsieh, P., Yamane, K. DNA mismatch repair: Molecular mechanism, cancer, and ageing. Mech Ageing Dev. 129 (7-8), 391-407 (2008).
- Jacobs-Palmer, E., Hingorani, M. M. The effects of nucleotides on MutS-DNA binding kinetics clarify the role of MutS ATPase activity in mismatch repair. J Mol Biol. 366 (4), 1087-1098 (2007).
- Antony, E., Khubchandani, S., Chen, S., Hingorani, M. M., M, M. Contribution of Msh2 and Msh6 subunits to the asymmetric ATPase and DNA mismatch binding activities of Saccharomyces cerevisiae Msh2-Msh6 mismatch repair protein. DNA Repair (Amst). 5 (2), 153-162 (2006).
- Antony, E., Hingorani, M. M. Mismatch recognition-coupled stabilization of Msh2-Msh6 in an ATP-bound state at the initiation of DNA repair. Biochimica. 42 (25), 7682-7693 (2003).
- Finkelstein, J., Antony, E., Hingorani, M. M., O’Donnell, M. Overproduction and analysis of eukaryotic multiprotein complexes in Escherichia coli using a dual-vector strategy. Anal Biochem. 319 (1), 78-87 (2003).
- Zhai, J., Hingorani, M. M. S. cerevisiae Msh2-Msh6 DNA binding kinetics reveal a mechanism of targeting sites for DNA mismatch repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (2), 680-685 (2010).
- Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E., Webb, M. R. Direct, real-time measurement of rapid inorganic phosphate release using a novel fluorescent probe and its application to actomyosin subfragment 1 ATPase. Biochimica. 33 (27), 8262-8271 (1994).
- Brune, M. Mechanism of inorganic phosphate interaction with phosphate binding protein from Escherichia coli. Biochimica. 37 (29), 10370-10380 (1998).
- Antony, E., Hingorani, M. M. Asymmetric ATP binding and hydrolysis activity of the Thermus aquaticus MutS dimer is key to modulation of its interactions with mismatched DNA. Biochimica. 43 (41), 13115-13128 (2004).
- Gradia, S., Acharya, S., Fishel, R. The human mismatch recognition complex hMSH2-hMSH6 functions as a novel molecular switch. Cell. 91 (7), 995-1005 (1997).
- Mazur, D. J., Mendillo, M. L., Kolodner, R. D., D, R. Inhibition of Msh6 ATPase activity by mispaired DNA induces a Msh2(ATP)-Msh6(ATP) state capable of hydrolysis-independent movement along DNA. Mol Cell. 22 (1), 39-49 (2006).
