التطبيقية ليزر Microdissection التنميط التعبير الجيني للخلايا من المجموعة الثانوية من ذبابة الفاكهة جناح القرص
Summary
تم تطبيق الليزر لتحليل الجينات microdissection التنميط التعبير في مقصورات معينة من القرص جناح ذبابة الفاكهة تتعرض لرني المترجمة<em> في الجسم الحي</em>. وقد تم تحليل الحمض النووي الريبي المستخرج من مناطق يعادل المقصورات وإسكات unsilenced بواسطة RT – PCR الكمي لتحديد ملامح التعبير الجيني المقارن في سياق microecology الأنسجة الأصلية.
Abstract
وقد ثبت الطبيعة غير المتجانسة للأنسجة ليكون عاملا يحد من كمية المعلومات التي يمكن توليدها من العينات البيولوجية ، وتحليلات المساس المصب. النظر في الجمعيات المعقدة والديناميكية الخلوية الموجودة داخل العديد من الأنسجة ، من أجل أن ألخص في التفاعلات الجزيئية فيفو تحليل دقيق يجب على المرء أن يكون قادرا على تحليل السكان خلية معينة ضمن سياقها الأصلي. ويمكن بوساطة الليزر microdissection تحقيق هذا الهدف ، مما يسمح تحديد لا لبس فيها والحصاد الناجح للخلايا من الفائدة في ظل التصور المجهري المباشر مع المحافظة على سلامة الجزيئية. لقد طبقنا هذه التكنولوجيا لتحليل الجينات داخل مناطق محددة من القرص النامية جناح ذبابة الفاكهة ، وهو ما يمثل نظام نموذجي لدراسة المفيد مراقبة النمو ، وتمايز الخلايا وorganogenesis. وتنقسم precociously أقراص تخيلي اليرقات داخل المقصورات الأمامية والخلفية ، والظهري البطني بواسطة تقييد حدود النسب. الاستفادة من محرض GAL4 – UAS نظام ثنائي التعبير ، ويمكن لكل من هذه المقصورات المسمى تحديدا في الذباب المعدلة وراثيا إبداء التحوير UAS – GFP تحت سيطرة المناسبة GAL4 سائق بناء. في الأقراص المعدلة وراثيا ، ويمكن على وجه التحديد التنميط الجيني التعبير عن مجموعات فرعية منفصلة من الخلايا يتحدد بعد بوساطة الليزر microdissection ، وذلك باستخدام إشارة GFP الفلورسنت لتوجيه الليزر قطع.
من بين مجموعة متنوعة من التطبيقات المصب ، وركزنا على التنميط النص بعد تدخل الحمض النووي الريبي RNA مترجم (رني). مع ظهور التكنولوجيا رني ، يمكن أن يترافق مع وضع العلامات GFP ضربة قاضية المترجمة من جين معين ، مما يسمح للاستجابة الترانسكربتي الحاسم للسكان الخلية المنفصلة إلى إسكات جينات معينة. للتحقق من صحة هذا النهج ، ونحن تشريح المناطق يعادل القرص من الخلفي (المسمى من قبل التعبير GFP) ، والأمامي (لا تحمل علامات) مقصورة على إسكات الإقليمية في المقصورة ف من الجينات على خلاف ذلك أعرب بتواجد مطلق تم استخراج الحمض النووي الريبي من microdissected المناطق أسكت وunsilenced والمقارنة التنميط التعبير الجيني التي تحددها الكمية في الوقت الحقيقي RT – PCR. يمكن أن نظهر هذه الطريقة فعالة لتطبيقها transcriptomics دقيقة من مجموعات فرعية من الخلايا داخل أقراص تخيلي ذبابة الفاكهة. في الواقع ، في حين ضخمة إعداد القرص كمصدر من الحمض النووي الريبي يفترض عموما التجانس الخلية ، فمن المعروف جيدا أن التعبير يمكن أن تختلف اختلافا كبيرا الترانسكربتي داخل هذه الهياكل في ذلك المعلومات الموضعية. باستخدام مترجم إشارة GFP الفلورسنت لتوجيه الليزر قطع ، يمكن إجراء تحليلات أكثر دقة والترانسكربتي تطبيق مربح لتطبيقات متباينة ، بما في ذلك التنميط نص الأنساب خلية مستقلة ضمن سياقها الأصلي.
Protocol
Discussion
فيما يتعلق مستوياتها التعبير القاعدية التي تحققت في المقصورات الأمامية / الخلفية من أقراص الجناح unsilenced ، تم العثور على نشاط الجين المحدد X خفضت الى 40 ٪ عند إسكات. في المقابل ، تم العثور على واحد من أهدافها المفترضة (الجينات Y) بشكل ملحوظ التنظيم (7 أضعاف الزيادة) ، مما يؤ…
Acknowledgements
الكتاب نشكر الاستاذ. كيارا كامبانيلا وعمرة مركز الاختصاص ، جامعة نابولي فيدريكو الثاني ، نابولي ، ايطاليا ، لتزويدهم استخدام microdissector الليزر ، والسيد فينتشنزو Vicidomini للحصول على مساعدة سخية في الرسوم المتحركة 3D.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| DEPC water | Sigma | W4502 | ||
| RNase Zap | Sigma | R2020 | ||
| TRI Reagent | Sigma | T9424 | ||
| SuperScript III | Invitrogen | 18080093 | ||
| Master Mix | Invitrogen | 11761100 | ||
| Agarose | Sigma | A9539 | ||
| Isopropyl alcohol | Sigma | I9516 | ||
| Chloroform | Sigma | C7559 | ||
| Dream taq | Fermentas | EP0701 |
Fly strains
Drosophila UAS-silencing lines can be obtained from VDRC RNAi collection 2. A collection of GAL4-driver lines is available at the Bloomington Drosophila Stock Center (Indiana, USA).
Equipment
Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5).
Tools
Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Riferimenti
- Elliott, D. A., Brand, A. H., Dahmann, C. The GAL4 System A Versatile System for the Expression of Gene. , (2008).
- Klein, T. Wing disc development in the fly: the early stages. . Current Opinion in Genetics & Development. 11, 470-475 (2001).
- Dietzl, G. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448, 151-U1-151-U1 (2007).
- Martin, F. A., Morata, G. Compartments and the control of growth in the Drosophila wing imaginal disc. Development. 133, 4421-4426 (2006).
- Tabata, T. Genetics of morphogen gradients. Nature Reviews Genetics. 2, 620-630 (2001).
- Moreno, E. &. a. m. p. ;. a. m. p., Basler, K. dMyc transforms cells into super-competitors. Cell. 117, 117-129 (2004).
