Laser Microdissection Toegepast op gen expressie profilering van de subset van cellen uit de Drosophila Wing Disc

Summary

Laser microdissection werd toegepast op de gen expressie profilering te analyseren in specifieke compartimenten van Drosophila vleugel schijf onderworpen aan een gelokaliseerde RNAi<em> In vivo</em>. RNA geëxtraheerd uit gelijkwaardige gebieden van zwijgen en unsilenced compartimenten werd geanalyseerd door kwantitatieve RT-PCR vergelijkende gen expressie profilering vast te stellen in het kader van inheemse weefsel microecology.

Abstract

Heterogene karakter van de weefsels heeft zich bewezen als een beperkende factor zijn in de hoeveelheid informatie die kan worden gegenereerd op basis van biologische monsters, ten koste gaat stroomafwaarts analyses. Gezien de complexe en dynamische cellulaire verenigingen bestaande in vele weefsels, om de in-vivo-interacties diepgaande moleculaire analyse samenvatten men moet in staat zijn om specifieke celpopulaties te analyseren in hun oorspronkelijke context. Laser-gemedieerde microdissectie kan dit doel te bereiken, waardoor ondubbelzinnige identificatie en succesvolle oogst van cellen van belang in de directe microscopische visualisatie met behoud van moleculaire integriteit. We hebben paste deze technologie om de genexpressie te analyseren in bepaalde gebieden van de ontwikkeling van Drosophila vleugel schijf, die een voordelig modelsysteem om de groei controleren, celdifferentiatie en organogenese studie vertegenwoordigt. Larvale verbeelding schijven zijn vroegtijdig onderverdeeld in voorste en achterste, dorsale en ventrale compartimenten door afkomst beperking grenzen. Door gebruik te maken van het induceerbare GAL4-UAS binaire expressie systeem, elk van deze compartimenten kunnen specifiek worden geëtiketteerd in transgene vliegen hebben een UAS-GFP transgene onder de controle van de juiste GAL4-driver te construeren. In de transgene schijven, kan de genexpressie profilering van discrete subsets van cellen nauwkeurig kan worden bepaald na de laser-gemedieerde microdissection, met behulp van de TL-GFP signaal naar laser gesneden gids.

Onder de variëteit van downstream-toepassingen, hebben we ons gericht op de RNA-transcript profilering na gelokaliseerde RNA-interferentie (RNAi). Met de komst van RNAi-technologie, kan de etikettering GFP gekoppeld worden met gelokaliseerde knockdown van een bepaald gen, het mogelijk maakt om de transcriptionele respons van een discrete celpopulatie aan de specifieke gen-silencing bepaald. Om deze aanpak te valideren, we ontleed gelijkwaardige gebieden van de schijf van de achterste (gelabeld door GFP expressie), en de voorste (ongelabelde) compartiment op het regionale zwijgen op te leggen in de P-compartiment van een alom anders uitgedrukt gen. RNA werd geëxtraheerd uit gemicrodissecteerde zwijgen opgelegd en unsilenced gebieden en vergelijkende gen expressie profilering bepaald door kwantitatieve real-time RT-PCR. We laten zien dat deze methode effectief kan worden toegepast voor nauwkeurige transcriptomics van subsets van cellen in het Drosophila imaginaire schijven. Sterker nog, terwijl de grote schijf voorbereiding als bron van RNA over het algemeen veronderstelt cel homogeniteit, is het algemeen bekend dat transcriptionele expressie sterk kan variëren binnen deze structuren ten gevolge van positionele informatie. Met behulp van gelokaliseerde fluorescerende GFP signaal naar laser gesneden gids, kunnen meer accurate transcriptie analyses worden uitgevoerd en winstgevend toegepast op uiteenlopende toepassingen, waaronder transcript profilering van verschillende cellijnen in hun oorspronkelijke context.

Protocol

Deel 1. De voorbereiding van Drosophila imaginaire Wing Discs onderworpen aan specifieke en lokale RNAi. Als biologisch materiaal, gebruikten we Drosophila verbeelding vleugels schijven verkregen uit transgene larven onderworpen aan de lokale en specifieke gene silencing door middel van het GAL4/UAS systeem 1. Deze larven nageslacht orginates van een genetische kruising waarbij twee ouders lijnen: een uitvoering van de GAL4 bestuurder, de tweede de UAS responder. I…

Discussion

Met betrekking tot hun basale expressie niveau bereikt in het voorste / achterste compartimenten van unsilenced vleugel schijven, was de activiteit van de geselecteerde gen X gevonden verlaagd tot 40% na zwijgen op te leggen. In tegenstelling, was een van zijn vermeende doelen (genen Y) significant gevonden up-gereguleerd (7 voudige-toename), die ons tot de hypothese te bevestigen dat het negatief was geregeld door Gene X.

We concluderen dat de hierboven beschreven experimentele benadering s…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
DEPC water		Sigma	W4502
RNase Zap		Sigma	R2020
TRI Reagent		Sigma	T9424
SuperScript III		Invitrogen	18080093
Master Mix		Invitrogen	11761100
Agarose		Sigma	A9539
Isopropyl alcohol		Sigma	I9516
Chloroform		Sigma	C7559
Dream taq		Fermentas	EP0701

Fly strains

Drosophila UAS-silencing lines can be obtained from VDRC RNAi collection ². A collection of GAL4-driver lines is available at the Bloomington Drosophila Stock Center (Indiana, USA).

Equipment

Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5).

Tools

Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).