Laser Mikrodissektion Angewandt auf Gene Expression Profiling von Untergruppe von Zellen aus dem Drosophila Wing Disc

Summary

Laser Mikrodissektion wurde angewandt, um Gene Expression Profiling in bestimmten Kompartimenten des Drosophila Flügel Scheibe analysieren unterzogen, um lokalisierte RNAi<em> In vivo</em>. RNA aus entsprechenden Bereichen zum Schweigen gebracht und unsilenced Fächer extrahiert wurde durch quantitative RT-PCR analysiert, um vergleichende Genexpressionsanalysen im Rahmen der nativen Gewebe Mikroökologie bestimmen.

Abstract

Heterogene Natur des Gewebes hat sich ein limitierender Faktor bei der Menge an Informationen, die aus biologischen Proben erzeugt werden können, Kompromisse Downstream-Analysen. Angesichts der komplexen und dynamischen zellulären Verbänden bestehende in vielen Geweben, um die in vivo Interaktionen gründliche molekulare Analyse rekapitulieren muss man in der Lage sein bestimmte Zellpopulationen in ihrer Muttersprache Kontext zu analysieren. Laser-vermittelte Mikrodissektion kann dieses Ziel zu erreichen, so dass eine eindeutige Identifizierung und erfolgreichen Ernte der Zellen von Interesse unter der direkten mikroskopischen Visualisierung unter Beibehaltung molekulare Integrität. Wir haben diese Technologie angewendet, um die Genexpression in definierten Gebieten der Entwicklungsländer Drosophila Flügel Disc, die ein vorteilhaftes Modellsystem, um Wachstum zu kontrollieren, der Zelldifferenzierung und Organentwicklung Studie stellt analysieren. Larven Imaginalscheiben sind frühzeitig in die vorderen und hinteren, dorsalen und ventralen Kammern durch Abstammung Einschränkung Grenzen unterteilt. Die Nutzung der induzierbaren GAL4-UAS binärer Ausdruck System, jedes dieser Fächer können gezielt in transgenen Fliegen Ausdruck einer UAS-GFP-Transgen unter der Kontrolle der entsprechenden GAL4-Treiber bauen gekennzeichnet werden. In den transgenen Discs können Genexpressionsanalysen von diskreten Untergruppen von Zellen genau nach Laser-vermittelte Mikrodissektion bestimmt werden, mit dem fluoreszierenden GFP-Signal an lasergeschnittenen führen.

Unter der Vielzahl der nachgelagerten Anwendungen, konzentrierten wir uns auf RNA-Transkript Profilierung nach lokalisierten RNA-Interferenz (RNAi). Mit dem Aufkommen der RNAi-Technologie können GFP-Markierung mit lokalisierten Knockdown von einem bestimmten Gen gekoppelt werden, so dass der Transkriptions-Reaktion eines diskreten Zellpopulation, die Gen-Silencing bestimmten. Zur Validierung dieses Ansatzes haben wir entsprechende Bereiche der Scheibe aus dem hinteren (gekennzeichnet durch die GFP-Expression) zerlegt, und die anterior (unbeschriftet) Fach auf regionaler Silencing in der P-Fach eines ansonsten ubiquitär exprimierten Gen. RNA wurde aus mikrodissezierten zum Schweigen gebracht und unsilenced Bereichen und vergleichende Genexpressionsanalysen mittels quantitativer real-time RT-PCR bestimmt extrahiert. Wir zeigen, dass diese Methode effektiv für eine genaue Transkriptomik von Teilmengen von Zellen innerhalb des Drosophila Imaginalscheiben angewendet werden. In der Tat, während der massive Scheibe Zubereitung als Quelle der RNA in der Regel davon ausgegangen Zelle Homogenität, ist es bekannt, dass transkriptionelle Expression kann stark variieren innerhalb dieser Strukturen in Folge der Positionsinformationen. Mit lokalisierten fluoreszierenden GFP-Signal an lasergeschnittenen Führer, können genauere transkriptionelle Analysen durchgeführt werden und profitabel zu verschiedenen Anwendungen, einschließlich Abschrift Profilierung der verschiedenen Zelllinien in ihrer Muttersprache Kontext angewendet.

Protocol

Teil 1. Vorbereitung von Drosophila Imaginal Flügel Discs unterzogen Spezifische und lokalisierte RNAi. Als biologisches Material verwendeten wir Drosophila imaginalen Flügel Scheiben aus transgenen Larven unterzogen, um die lokale und spezifische Gen-Silencing durch die GAL4/UAS System 1 erhalten. Diese Larven Nachkommen entstammt das aus einer genetischen Kreuzung mit zwei elterlichen Linien: eine Durchführung der GAL4-Treiber, der zweite die UAS-Responder. Ne…

Discussion

Mit Bezug auf ihre basale Expression in der vorderen / hinteren Abteile unsilenced Flügel Scheiben erreicht, wurde die Aktivität des ausgewählten Gens X gefunden reduziert auf 40% bei Schweigen. Im Gegensatz dazu war eine seiner vermeintlichen Ziele (Gene Y) deutlich hochreguliert (7-facher Anstieg) gefunden, was uns zu der Hypothese bestätigen, dass es negativ wurde von Gen X. geregelt

Wir schließen daraus, dass die oben beschriebenen experimentellen Ansatz erfolgreich auf die Validier…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
DEPC water		Sigma	W4502
RNase Zap		Sigma	R2020
TRI Reagent		Sigma	T9424
SuperScript III		Invitrogen	18080093
Master Mix		Invitrogen	11761100
Agarose		Sigma	A9539
Isopropyl alcohol		Sigma	I9516
Chloroform		Sigma	C7559
Dream taq		Fermentas	EP0701

Fly strains

Drosophila UAS-silencing lines can be obtained from VDRC RNAi collection ². A collection of GAL4-driver lines is available at the Bloomington Drosophila Stock Center (Indiana, USA).

Equipment

Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5).

Tools

Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).