Microdissezione laser applicata a profili di espressione genica di sottogruppo di cellule dal Drosophila Ala Disco

Summary

Microdissezione laser è stato applicato per analizzare il profilo di espressione genica in specifici comparti di disco Drosophila ala sottoposta a localizzate RNAi<em> In vivo</em>. RNA estratto da aree equivalenti dei comparti tacere e unsilenced è stato analizzato mediante RT-PCR quantitativa per determinare comparativa profili di espressione genica nel contesto di microecology tessuto nativo.

Abstract

Natura eterogenea dei tessuti ha dimostrato di essere un fattore limitante per la quantità di informazioni che possono essere generati da campioni biologici, compromettendo le analisi a valle. Considerando le associazioni complesso e dinamico cellulari esistenti in molti tessuti, per ricapitolare le interazioni in vivo analisi molecolare si deve essere in grado di analizzare popolazioni di cellule specifiche all'interno del loro contesto d'origine. Laser-mediata microdissezione può raggiungere questo obiettivo, consentendo l'identificazione univoca e la raccolta di successo delle cellule di interesse sotto il diretto visualizzazione microscopica, pur mantenendo l'integrità molecolare. Abbiamo applicato questa tecnologia per analizzare l'espressione genica nelle aree definite di sviluppare disco Drosophila ala, che rappresenta un vantaggioso sistema modello per studiare il controllo della crescita, differenziazione cellulare e l'organogenesi. Larvale dischi immaginale precocemente sono suddivise in compartimenti anteriore e posteriore, dorsale e ventrale da confini restrizione lignaggio. Avvalendosi della inducibile GAL4-UAS sistema di espressione binario, ciascuno di questi comparti possono essere etichettate in modo specifico le mosche transgeniche esprimere un transgene UAS-GFP sotto il controllo del competente GAL4-driver costruire. Nei dischi transgenici, il profilo di espressione genica di sottoinsiemi discreti di cellule possono essere, appunto, determinata dopo microdissezione laser-mediata, utilizzando il segnale fluorescente GFP guidare taglio laser.

Tra le varietà di applicazioni a valle, ci siamo concentrati sulla profilazione trascrizione RNA dopo localizzato interferenza dell'RNA (RNAi). Con l'avvento della tecnologia RNAi, GFP etichettatura può essere accoppiato con knockdown localizzata di un dato gene, che consente di determinare la risposta trascrizionale di una popolazione di cellule discreti per il silenziamento genico specifico. Per convalidare questo approccio, abbiamo sezionato aree equivalenti del disco dalla parte posteriore (l'etichetta di espressione GFP), e la parte anteriore (non marcato) su vano tacere regionali nel comparto P di un altro gene ubiquitariamente espresso. L'RNA è stato estratto da microdissezionate aree tacere e unsilenced e comparativa profili di espressione genica determinata dalla quantitativa real-time RT-PCR. Abbiamo dimostrato che questo metodo può essere efficacemente applicato per trascrittomica accurata di sottoinsiemi di cellule all'interno dei dischi immaginale Drosophila. Infatti, mentre la preparazione del disco di massa come fonte di RNA assume generalmente omogeneità cellulare, è ben noto che l'espressione trascrizionale può variare notevolmente all'interno di queste strutture a seguito di informazioni di posizione. Utilizzando localizzato segnale fluorescente GFP per guidare taglio laser, analisi trascrizionale più accurata può essere eseguita e proficuamente applicati alle domande più disparate, tra cui profili trascrizione di linee cellulari distinte nel loro contesto d'origine.

Protocol

Parte 1. Preparazione di Drosophila Dischi Ala immaginale Sottoposto a specifico e localizzato RNAi. Come materiale biologico, abbiamo usato Drosophila dischi ala immaginale ottenuti da larve transgeniche sottoposto al silenziamento del gene localizzato e specifico per mezzo del sistema GAL4/UAS 1. Questa progenie larvale orginates da un incrocio genetico che coinvolge due linee parentali: uno porta la conducente GAL4, il secondo il risponditore SUP. Oltre ad espri…

Discussion

Per quanto riguarda i loro livelli di espressione basale raggiunti negli scompartimenti anteriore / posteriore dei dischi ala unsilenced, l'attività del gene X selezionato è stato trovato ridotto al 40% alla tacere. Al contrario, uno dei suoi obiettivi putativi (geni Y) è stata trovata significativamente up-regolati (7 volte-aumento), che ci porta a convalidare l'ipotesi che fosse regolato negativamente dal gene X.

Concludiamo che l'approccio sperimentale sopra descritto può …

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
DEPC water		Sigma	W4502
RNase Zap		Sigma	R2020
TRI Reagent		Sigma	T9424
SuperScript III		Invitrogen	18080093
Master Mix		Invitrogen	11761100
Agarose		Sigma	A9539
Isopropyl alcohol		Sigma	I9516
Chloroform		Sigma	C7559
Dream taq		Fermentas	EP0701

Fly strains

Drosophila UAS-silencing lines can be obtained from VDRC RNAi collection ². A collection of GAL4-driver lines is available at the Bloomington Drosophila Stock Center (Indiana, USA).

Equipment

Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5).

Tools

Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).