레이저 Microdissection는 세포의 하위 집합 유전자 발현 프로 파일링에 적용 Drosophila 윙 디스크
Summary
레이저 microdissection은 현지화된 RNAi를 받게 Drosophila 날개 디스크의 특정 구획에있는 유전자 발현 프로 파일링을 분석에 적용되었다<em> 생체내에</em>. 침묵과 unsilenced 구획의 상당 지역에서 추출한 RNA는 기본 조직 microecology의 컨텍스트 내에서 비교 유전자 발현 프로 파일링을 결정하는 정량 RT – PCR로 분석했다.
Abstract
조직의 이질적인 성격 스트림 분석을 손상, 생물 학적 샘플에서 생성된 수있는 정보의 양을에 제한 요소로 입증되었습니다. 생체내 상호 작용의 분자 철저한 분석을 요점을 되풀이하기 위해 많은 조직 내의 기존의 복잡하고 역동적인 세포 연결을 고려 하나는 자신의 기본 컨텍스트 내에서 특정 세포 인구를 분석할 수 있어야합니다. 레이저 중재의 microdissection은 분자 무결성을 유지하면서 직접 미세한 시각에 따라 관심의 세포의 모호하지 식별 및 풍작을 수 있도록,이 목표를 달성하실 수 있습니다. 우리는 성장 조절, 세포 분화 및 organogenesis를 연구하는 유리한 모델 시스템을 대표하는 개발 Drosophila 날개 디스크의 정의된 영역 내에서 유전자 발현을 분석하는이 기술을 적용했습니다. 애벌레 imaginal 디스크는 천재적으로 가계 제한 경계에 의해 앞쪽에 및 사후, 지느러미 및 복부 구획으로 세분화됩니다. inducible GAL4 – UAS 이진 표현 시스템이 구획의 각 특별히 만들 GAL4 – 드라이버 해당의 통제하에 UAS – GFP transgene을 표현 형질 전환 파리에서 라벨 수있는 사용하고. 형질 디스크에서 세포의 개별 하위 집합의 유전자 발현 프로 파일링은 정확하게 레이저 절단을 안내하기 위해 형광 GFP 신호를 사용하여 레이저 중재 microdissection 후 결정하실 수 있습니다.
하류 응용 프로그램의 다양한 가운데, 우리는 지역화된 RNA 간섭 (RNAi) 이후 RNA의 성적표 프로 파일링에 집중했다. RNAi 기술의 출현과 함께, GFP 라벨은 특정 유전자 입을 수있는 분리된 세포 인구의 transcriptional 응답을 한정된 수 있도록, 주어진 유전자의 현지 최저와 결합 수 있습니다. 이 방법의 유효성을 검사하기 위해, 우리는 (GFP 표현으로 표시) 뒷부분에서 디스크의 동일한 영역을 해부하고, 그렇지 않으면 ubiquitously 표현 유전자의 P의 구획에 지역 입을시 앞쪽에 (unlabelled) 구획. RNA는 microdissected 침묵과 unsilenced 영역과 정량 실시간 RT – PCR에 의해 결정 비교 유전자 발현 프로 파일링에서 추출한했다. 우리는이 방법이 효과적으로 Drosophila imaginal 디스크 내에서 세포의 하위 집합의 정확한 transcriptomics에 대해 적용할 수 것을 보여줍니다. RNA의 소스로 거대한 디스크 준비가 일반적으로 세포 균질성을지지하면서 실제로, 그것은 잘 transcriptional 표현이 위치 정보의 결과에서 이러한 구조 내에서 크게 달라질 수 있다고 알려져 있습니다. 레이저 절단을 안내화된 형광 GFP 신호를 사용하여보다 정확한 transcriptional 분석이 수행하고 수익성 자신의 기본 컨텍스트 내에서 서로 다른 세포 lineages의 사본 프로 파일링 포함하여 서로 다른 응용 프로그램에 적용할 수 있습니다.
Protocol
Discussion
unsilenced 날개 디스크의 앞쪽에 / 후부 구획에 달성 자신의 기초 표현 수준과 관련하여, 선택된 유전자 X의 활동이 입을시 40 %까지 감소 발견되었습니다. 대조적으로, 자사의 putative 목표 (유전자 Y) 중 하나는 우리가 부정적인 유전자 X. 규제했다는 가설을 검증하기 위해 선도적인, (7 접이식 증가)까지 – 규제 대폭 발견
우리는 위에서 설명한 실험 방법이 성공적으로 다양한 규?…
Acknowledgements
저자 프로프 감사합니다. 키아 라 캄파넬라과 경쟁력의 암라 센터, 레이저 microdissector의 사용과 그들을 제공하는 나폴리 페데리코 II 대학, 나폴리, 이태리, 그리고 3D 애니메이션 관대한 도움 씨 빈센조 Vicidomini.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| DEPC water | Sigma | W4502 | ||
| RNase Zap | Sigma | R2020 | ||
| TRI Reagent | Sigma | T9424 | ||
| SuperScript III | Invitrogen | 18080093 | ||
| Master Mix | Invitrogen | 11761100 | ||
| Agarose | Sigma | A9539 | ||
| Isopropyl alcohol | Sigma | I9516 | ||
| Chloroform | Sigma | C7559 | ||
| Dream taq | Fermentas | EP0701 |
Fly strains
Drosophila UAS-silencing lines can be obtained from VDRC RNAi collection 2. A collection of GAL4-driver lines is available at the Bloomington Drosophila Stock Center (Indiana, USA).
Equipment
Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5).
Tools
Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Riferimenti
- Elliott, D. A., Brand, A. H., Dahmann, C. The GAL4 System A Versatile System for the Expression of Gene. , (2008).
- Klein, T. Wing disc development in the fly: the early stages. . Current Opinion in Genetics & Development. 11, 470-475 (2001).
- Dietzl, G. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448, 151-U1-151-U1 (2007).
- Martin, F. A., Morata, G. Compartments and the control of growth in the Drosophila wing imaginal disc. Development. 133, 4421-4426 (2006).
- Tabata, T. Genetics of morphogen gradients. Nature Reviews Genetics. 2, 620-630 (2001).
- Moreno, E. &. a. m. p. ;. a. m. p., Basler, K. dMyc transforms cells into super-competitors. Cell. 117, 117-129 (2004).
