Laser Microdissection Tillämpat på Gene Expression Profilering av delmängd av celler från Drosophila Wing skiva

Summary

Laser microdissection har tillämpats för att analysera profilering av genuttryck i specifika fack Drosophila vingen skiva utsätts för lokaliserad RNAi<em> In vivo</em>. RNA extraheras från motsvarande områden tystas och unsilenced fack analyserades med kvantitativ RT-PCR för att bestämma jämförande profilering av genuttryck i samband med infödda vävnad microecology.

Abstract

Heterogena karaktär vävnader har visat sig vara en begränsande faktor i den mängd information som kan genereras från biologiska prover, kompromissa nedströms analyser. Med tanke på den komplexa och dynamiska cellulära föreningar finns inom många vävnader, för att sammanfatta in vivo interaktioner grundliga molekylär analys ett måste kunna analysera specifika cellpopulationer i sitt eget sammanhang. Laser-medierad microdissection kan uppnå detta mål, så otvetydig identifiering och framgångsrik skörd av celler av intresse i direkt mikroskopiska visualisering bibehållen molekylär integritet. Vi har tillämpat denna teknik för att analysera genuttryck inom definierade områden i utvecklingsländer Drosophila vingen skiva, vilket motsvarar ett fördelaktigt modellsystem för att studera tillväxt kontroll, celldifferentiering och organogenesen. Larver imaginal skivor är precociously indelas i främre och bakre, rygg-och ventral fack med gränser härstamning begränsning. Att använda sig av den inducerbara GAL4-UAS binära uttryck systemet, var och en av dessa avdelningar kan speciellt märkas transgena flugor som uttrycker en UAS-GFP transgenen under kontroll av lämplig GAL4-driver konstruktion. I transgena skivor kan profilering av genuttryck för diskreta undergrupper av celler exakt bestäms efter laser-medierad microdissection, med hjälp av fluorescerande GFP signalen att vägleda laserskurna.

Bland de många olika tillämpningar i efterföljande led har vi fokuserat på RNA avskrift profilering efter lokaliserade RNA-interferens (RNAi). Med tillkomsten av RNAi-teknik kan GFP märkning kopplas med lokaliserade ÖVERVÄLDIGANDE av en viss gen, så att bestämda i transkriptionell svar på en diskret cellpopulation till den specifika geners uttryck. För att validera denna metod, dissekerade vi motsvarande områden av skivan från den bakre (märkt av GFP uttryck), och den främre (omärkta) facket på regionala tysta i P-facket i en annars ubiquitously uttryckt gen. RNA var ur microdissected tystas och unsilenced områden och jämförande profilering av genuttryck bestäms av kvantitativ realtids-RT-PCR. Vi visar att denna metod på ett effektivt sätt kan användas för noggranna transkriptomik av delmängder av celler i Drosophila imaginal skivor. I själva verket, medan massiva skiva förberedelser som källa av RNA allmänhet förutsätter cell homogenitet är det väl känt att transkriptionell uttryck kan variera kraftigt inom dessa strukturer till följd av positionsinformation. Använda lokaliserad fluorescerande GFP-signal för att styra laserskurna, kan mer exakt transkriptionell analyser göras och lönsamt tillämpas för olika tillämpningar, inklusive utskrift profilering av olika cell linjer inom sitt eget sammanhang.

Protocol

Del 1. Beredning av Drosophila Imaginal Wing skivor på särskilda och lokal RNAi. Som biologiskt material har vi använt Drosophila imaginal vinge skivor från transgena larver utsättas för lokala och specifika geners uttryck med hjälp av GAL4/UAS systemet 1. Detta larver avkomma orginates från en genetisk kors med två föräldrar linjer: en som bär GAL4 föraren, den andra yrkeshögskolan responder. Förutom att uttrycka GAL4 i en specifik tid och / eller r…

Discussion

Med avseende på deras basala uttryck nivåer som uppnåddes i den främre / bakre fack unsilenced vinge skivor, var aktiviteten på den valda genen x hittade sänkas till 40% på ljuddämpning. Däremot var en av dess förmodade mål (gener Y) fann signifikant upp-reglerade (7 faldig-ökning), leder oss att bekräfta hypotesen att det negativt regleras av genen X.

Vi drar slutsatsen att de ovan beskrivna experimentella metoden framgångsrikt kan tillämpas på validering av förmodade mål …

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
DEPC water		Sigma	W4502
RNase Zap		Sigma	R2020
TRI Reagent		Sigma	T9424
SuperScript III		Invitrogen	18080093
Master Mix		Invitrogen	11761100
Agarose		Sigma	A9539
Isopropyl alcohol		Sigma	I9516
Chloroform		Sigma	C7559
Dream taq		Fermentas	EP0701

Fly strains

Drosophila UAS-silencing lines can be obtained from VDRC RNAi collection ². A collection of GAL4-driver lines is available at the Bloomington Drosophila Stock Center (Indiana, USA).

Equipment

Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5).

Tools

Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).