Lazer Diseksiyon hücreleri Altküme Kaynak gösterilmeden Uygulanan Drosophila Kanat Disk
Summary
Lazer mikrodiseksiyon Drosophila kanat diskin belirli bölümlerinde lokalize RNAi tabi gen ekspresyonu analiz etmek için uygulanan<em> In vivo</em>. RNA susturulması ve unsilenced bölmeleri eşdeğer alanlarında çıkarılan doğal dokuya microecology bağlamında karşılaştırmalı gen ekspresyon profili belirlemek için kantitatif RT-PCR ile analiz edildi.
Abstract
Dokuların heterojen doğası, mansap analizleri ödün, biyolojik örnekler üretilen bilgi miktarı kısıtlayıcı bir faktör olduğu kanıtlanmıştır. In vivo etkileşimleri kapsamlı moleküler analiz özetlemek için, birçok dokuda içinde varolan karmaşık ve dinamik hücresel dernekler göz önüne alındığında biri kendi ana kapsamında özel hücre popülasyonlarının analiz etmek gerekir. Lazer-aracılı mikrodiseksiyon moleküler bütünlüğünü korurken ilgi hücreleri doğrudan mikroskobik görüntü altında açık kimliği ve başarılı bir hasat sağlayarak, bu hedefe ulaşabilirsiniz. Biz, büyüme kontrolü, hücre farklılaşması ve organogenez çalışma için avantajlı bir model sistemi temsil eden gelişmekte olan Drosophila kanat disk, tanımlı alanlar içinde gen ekspresyonu analiz etmek için bu teknolojiyi uyguladık. Larvaların hayali diskler precociously soy kısıtlama sınırları anterior ve posterior, dorsal ve ventral bölmelere ayrılmıştır. Indüklenebilir GAL4 UAS ikili ifade sistemi, bu bölmelerin her biri özel olarak inşa GAL4 uygun sürücünün kontrolü altında bir UAS-GFP transgen ifade transgenik sinekler etiketli olabilir kullanılması. Transgenik diskler, ayrık altkümelerini hücreleri gen ekspresyon profili tam olarak, lazer kesim kılavuzu floresan GFP sinyali kullanılarak, lazer aracılı mikrodiseksiyon sonra tespit edilebilir.
Çeşitli aşağı uygulamaları arasında, lokalize RNA enterferans (RNAi) sonra RNA transkript profil üzerinde duruldu. GFP etiketleme, RNAi teknolojisi gelişiyle birlikte, belirli bir gen susturulması için ayrı bir hücre popülasyonu transkripsiyonel yanıt tespitine izin verilen bir genin lokalize demonte ile birleştiğinde olabilir. Bu yaklaşımı doğrulamak için, diskin posterior (GFP ifade etiketli) eşdeğer alanlar diseke ve bir başka yerde eksprese gen P bölmesi bölgesel susturulması üzerine anterior (etiketsiz) bölmesi. RNA microdissected susturulması ve unsilenced alanları ve kantitatif gerçek zamanlı RT-PCR tarafından belirlenen karşılaştırmalı gen ekspresyon profili çıkarılmıştır. Biz bu yöntem etkili Drosophila hayali diskler içinde hücreler altkümelerini doğru transkriptomik için uygulanabilir olduğunu göstermektedir. RNA kaynağı olarak büyük disk hazırlığı genellikle hücre homojenlik varsayar Nitekim, iyi transkripsiyonel ifade pozisyon bilgisi sonucunda bu yapıların içinde büyük ölçüde değişebilir bilinir. Lazer kesim kılavuzu lokalize floresan GFP sinyalini kullanarak, daha doğru transkripsiyonel analizleri yapılır ve kârlı onların yerli kapsamında farklı hücre soylarının transkript profil de dahil olmak üzere farklı uygulamaları, uygulanabilir.
Protocol
Discussion
Unsilenced kanat disklerin ön / arka bölümlerinde elde bazal ekspresyon düzeyleri ile ilgili olarak, seçilen gen X faaliyet susturulması üzerine% 40 düşürüldü bulundu. Bunun aksine, olası hedefler (genler Y) biri bizi olumsuz X geni tarafından düzenlenir olduğu hipotezi doğrulamak için önde gelen (7 kat artış) up-regüle önemli ölçüde bulundu
Biz, yukarıda açıklanan deneysel yaklaşım, çeşitli yasal yollar varsayılan hedeflerinin doğrulama başarıyla uygulan…
Acknowledgements
Yazarlar prof teşekkür ederim. Chiara Campanella ve Amra Yetkinlik Merkezi, lazer microdissector kullanımını sağlayarak Naples Federico II Üniversitesi, Napoli, İtalya, ve 3D animasyon cömert yardım için Bay Vincenzo Vicidomini.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| DEPC water | Sigma | W4502 | ||
| RNase Zap | Sigma | R2020 | ||
| TRI Reagent | Sigma | T9424 | ||
| SuperScript III | Invitrogen | 18080093 | ||
| Master Mix | Invitrogen | 11761100 | ||
| Agarose | Sigma | A9539 | ||
| Isopropyl alcohol | Sigma | I9516 | ||
| Chloroform | Sigma | C7559 | ||
| Dream taq | Fermentas | EP0701 |
Fly strains
Drosophila UAS-silencing lines can be obtained from VDRC RNAi collection 2. A collection of GAL4-driver lines is available at the Bloomington Drosophila Stock Center (Indiana, USA).
Equipment
Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5).
Tools
Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Riferimenti
- Elliott, D. A., Brand, A. H., Dahmann, C. The GAL4 System A Versatile System for the Expression of Gene. , (2008).
- Klein, T. Wing disc development in the fly: the early stages. . Current Opinion in Genetics & Development. 11, 470-475 (2001).
- Dietzl, G. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448, 151-U1-151-U1 (2007).
- Martin, F. A., Morata, G. Compartments and the control of growth in the Drosophila wing imaginal disc. Development. 133, 4421-4426 (2006).
- Tabata, T. Genetics of morphogen gradients. Nature Reviews Genetics. 2, 620-630 (2001).
- Moreno, E. &. a. m. p. ;. a. m. p., Basler, K. dMyc transforms cells into super-competitors. Cell. 117, 117-129 (2004).
