Due-Photon-Based fotoattivazione in Live embrioni di zebrafish

Summary

Microscopia multiphoton permette il controllo di fotoni a bassa energia con profonda penetrazione ottica e fototossicità ridotto. Descriviamo l'uso di questa tecnologia per l'etichettatura delle cellule vive in embrioni di zebrafish. Questo protocollo può essere facilmente adattato per foto-induzione di varie molecole di luce-sensibile.

Abstract

Fotoattivazione di composti target in un organismo vivente si è dimostrato un valido approccio per studiare vari processi biologici quali lo sviluppo embrionale, segnalazione cellulare e la fisiologia adulta. A questo proposito, l'uso del multi-fotone microscopia permette fotoattivazione quantitativa di un dato agente luce reattivo nei tessuti profondi con una risoluzione singola cella. Come embrioni di zebrafish sono otticamente trasparenti, il loro sviluppo può essere monitorata in vivo. Queste caratteristiche rendono il pesce zebra un organismo modello perfetto per controllare l'attività di una varietà di agenti chimici e le proteine ​​dalla luce concentrata. Qui si descrivono l'uso della microscopia a due fotoni per indurre l'attivazione di chimicamente in gabbia fluoresceina, che a sua volta ci permette di seguire il destino delle cellule in vivo embrioni di zebrafish. Noi usiamo gli embrioni che esprimono un punto di riferimento vivo genetica (GFP) per individuare con precisione obiettivi e le cellule di interesse. Questa procedura può essere utilizzata allo stesso modo per un preciso attivazione luce indotta di proteine, ormoni, molecole di piccole dimensioni e altri composti in gabbia.

Protocol

Descriviamo un protocollo di etichettatura delle cellule utilizzando fluoresceina in gabbia, però, altre foto-attivabili coloranti e proteine ​​possono essere utilizzate allo stesso modo.

1. L'iniezione di fluorescina Caged

1. Preparare soluzione madre 5% (5 mg in gabbia-fluoresceina / 100 microlitri KCl 0,2 M) di destrano coniugato 4,5-dimetossi-2-nitrobenzyl (DMNB) in gabbia fluoresceina (10.000 MW destrano, anionici, Invitrogen, sonde molecolari, Carlsbad, CA , cat. no. D-3310). Aliquota e conservare in -20 ° C. Si noti che DMNB-gabbia fluoresceina è sensibile alla luce e dovrebbe essere tenuto al buio.
2. Preparare un t....

Discussion

Photo-attivabili composti sono molecole la cui funzione è mascherato fino a quando non sono illuminati con una specifica lunghezza d'onda (di solito UV), inducendo una reazione fotochimica che converte le molecole in uno stato chimicamente o biologicamente attive. Queste sonde forniscono strumenti molto potenti per la ricerca di biologia delle cellule, poiché l'attivazione può essere controllato con precisione temporalmente e spazialmente, limitando la loro esposizione alla luce.

Il .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluoresceina in gabbia 4,5-dimetossi-2-nitrobenzil (DMNB) coniugata con destrormi (10.000 MW destrano, anionico)	Sonde molecolari	Invitrogen	D-3310
Agarosio per canale di iniezione e piastre rivestite	Capillari in vetro a parete sottile Sigma-Aldrich	A9539
con filamento	World Precision Instruments, Inc.	TW100F-6
Estrattore per micropipette	Sutter Instrument Co.	P-97
Punta per microloader	Eppendorf	5242 956.003
Picopompa pneumatica	World Precision Instruments, Inc.	PV820
Feniltiourea (PTU)	Sigma-Aldrich	22290-9
Agarosio a basso punto di fusione per montaggio embrionale	Agarosio LMP ultra puro	16520100
Fosfatasi alcalina anti-fluoresceina (AP) Frammenti Fab Gruppo	Roche	11426338910
Gruppo Roche Fast Red	11496549001