Linéarisation du dosage des protéines Bradford
Summary
La précision et la sensibilité du dosage des protéines par le test rapide et pratique Bradford est compromise par la non-linéarité intrinsèque. Nous montrons une procédure de linéarisation simple qui augmente considérablement la précision, améliore la sensibilité du dosage d'environ 10 fois, et réduit considérablement les interférences par les détergents.
Abstract
Détermination des quantités de microgrammes de protéine de Bradford dans le bleu de Coomassie brillant essai est réalisé par la mesure de l'absorbance à 590 nm. Ce test permet de quantifier la plus courante de protéines rapides et simples dans les lysats cellulaires, les fractions cellulaires, ou des échantillons de protéines recombinantes, dans le but de la normalisation des mesures biochimiques. Toutefois, une non-linéarité intrinsèque compromis la sensibilité et la précision de cette méthode. Il est montré que dans des conditions test standard, le ratio des mesures d'absorbance à 590 nm et 450 nm est strictement linéaire avec la concentration de protéines. Cette procédure simple augmente la précision et améliore la sensibilité du dosage d'environ 10 fois, la quantification permettant à 50 ng d'albumine sérique bovine. Par ailleurs, le brouillage couramment introduites par les détergents qui sont utilisés pour créer les lysats cellulaires est fortement réduite par le nouveau protocole. Une équation linéaire développé sur la base d'une action de masse et la loi de Beer s'adapte parfaitement aux données expérimentales.
Protocol
Discussion
Le dosage des protéines de Bradford est populaire en raison de sa facilité d'exécution et de la sensibilité relative. La linéarisation sur les concentrations de protéine ensemble de la gamme obtenue par le protocole présenté ici simplifie encore le dosage, comme des échantillons inconnus n'ont pas besoin de tomber dans la plage de la courbe d'étalonnage.
Fait important, le protocole prévoit en outre améliorée les avantages suivants sur l'original du protocole de …
Acknowledgements
Cet article est dédié à la mémoire du regretté Dr Zvi Selinger, qui a accueilli la recherche originale décrite ici.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Bradford reagent | Bio-Rad Laboratories | 500-0006 | ||
| Bovine Serum Albumin | Amersco | 0332 | ||
| Multiplate absorbance reader | BioTek | Synergy2 |
Riferimenti
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Chial, H. J., Thompson, H. B., Splittgerber, A. G. A spectral study of the charge forms of Coomassie blue G. Anal Biochem. 209, 258-266 (1993).
- Chial, H. J., Splittgerber, A. G. A comparison of the binding of Coomassie brilliant blue to proteins at low and neutral pH. Anal Biochem. 213, 362-369 (1993).
- Compton, S. J., Jones, C. G. Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay. Anal Biochem. 151, 369-374 (1985).
- Congdon, R. W., Muth, G. W., Splittgerber, A. G. The binding interaction of Coomassie blue with proteins. Anal Biochem. 213, 407-413 (1993).
- Zor, T., Selinger, Z. Linearization of the Bradford protein assay increases its sensitivity: theoretical and experimental studies. Anal Biochem. 236, 302-308 (1996).
