La precisione e la sensibilità di determinazione delle proteine da parte del test rapido e conveniente Bradford è compromessa dalla non linearità intrinseca. Mostriamo una semplice procedura di linearizzazione che aumenta notevolmente la precisione, migliora la sensibilità del test di circa 10 volte, e riduce significativamente le interferenze da detergenti.
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Articolo metodologico
Linearizzazione del saggio proteine Bradford
In questo articolo
Sommario
Abstract
Determinazione delle quantità di microgrammi di proteina nel saggio Bradford brillante blu Coomassie si ottiene la misura di assorbanza a 590 nm. Questo test permette di quantificare più comuni proteine rapido e semplice in lisati di cellule, frazioni cellulari, o campioni di proteine ricombinanti, ai fini della normalizzazione delle misure biochimiche. Tuttavia, un non-linearità intrinseca compromette la sensibilità e la precisione di questo metodo. E 'dimostrato che in condizioni di test standard, il rapporto tra le misure di assorbanza a 590 nm e 450 nm è strettamente lineare con la concentrazione di proteine. Questa semplice procedura aumenta la precisione e migliora la sensibilità del dosaggio circa 10 volte, permettendo la quantificazione fino al 50 ng di sieroalbumina bovina. Inoltre, l'interferenza introdotta da detergenti comunemente utilizzati per creare i lisati cellulari è notevolmente ridotta dal nuovo protocollo. Una equazione lineare sviluppato sulla base di azione di massa e la legge Beer si adatta perfettamente ai dati sperimentali.
Protocollo
Linearizzazione della curva di taratura Proteine Bradford:
Il brillante saggio di proteine Coomassie blu, comunemente noto come il saggio Bradford 1, è ampiamente utilizzato per il suo protocollo rapidi e convenienti così come la sua sensibilità relativa. Purtroppo, c'è un ampio grado di curvatura su una vasta gamma di concentrazioni di proteine (Fig. 1). Pertanto, solo una gamma ristretta di relativamente alte concentrazioni di proteine, 2-10 mg / ml BSA, viene utilizzato per la curva di taratura, che poi si adatta meglio di regressione lineare (Fig. 1, verde). Tuttavia, la non linearità richiede una concentrazione proteic....
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Discussione
Il dosaggio di proteine Bradford è popolare grazie alla sua facilità di prestazioni e di sensibilità relativa. La linearizzazione sulle concentrazioni proteina intera gamma ottenuto dal protocollo presentato qui semplifica ulteriormente l'analisi, come campioni sconosciuti non hanno bisogno di rientrare nel campo della curva di calibrazione.
È importante sottolineare che il protocollo migliorata Provvede inoltre i seguenti vantaggi rispetto l'originale Bradford protocollo:
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Ringraziamenti
Questo saggio è dedicato alla memoria del compianto Dr. Zvi Selinger, che ha ospitato la ricerca originale descritta qui.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagente di Bradford | Bio-Rad | 500-0006 | |
| Albumina sierica bovina | Amersco | 0332 | |
| Lettore multipiastra per assorbanza | BioTek | Synergy2 |
Riferimenti
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Chial, H. J., Thompson, H. B., Splittgerber, A. G.
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Ristampe e permessi
