Summary
A precisão e sensibilidade da determinação de proteína pelo ensaio Bradford rápida e conveniente é comprometida pela não-linearidade intrínseca. Nós mostramos um procedimento de linearização simples que aumenta a precisão, melhora a sensibilidade do ensaio cerca de 10 vezes, e reduz significativamente a interferência por detergentes.
Abstract
Determinação das quantidades microgramas de proteína no ensaio Bradford Coomassie azul brilhante é realizado pela medição da absorbância a 590 nm. Este ensaio mais comum permite a quantificação de proteínas rápidas e simples em lisados celulares, frações celulares, ou amostras de proteínas recombinantes, com a finalidade de normalização das dosagens bioquímicas. No entanto, uma não-linearidade intrínseca compromete a sensibilidade e precisão deste método. É mostrado que, sob condições de ensaio padrão, a relação entre as medidas de absorbância a 590 nm e 450 nm é estritamente linear com a concentração de proteína. Este simples procedimento aumenta a precisão e melhora a sensibilidade do ensaio cerca de 10 vezes quantificação, permitindo até 50 ng de albumina bovina. Além disso, a interferência comumente introduzidas por detergentes que são utilizados para criar a lisados celulares é muito reduzida pelo novo protocolo. Uma equação linear desenvolvido com base em ação de massa e lei de Beer se encaixa perfeitamente os dados experimentais.
Protocol
Discussion
O ensaio de proteína Bradford é popular devido à sua facilidade de desempenho e de sensibilidade relativa. A linearização sobre as concentrações de proteína toda a gama obtidos pelo protocolo aqui apresentado simplifica ainda mais o ensaio, como amostras desconhecidas não precisa estar dentro do intervalo da curva de calibração.
Importante, o protocolo prevê ainda melhorou as seguintes vantagens sobre o original Bradford protocolo:
- Maior precisão.
- A sensib…
Acknowledgements
Este artigo é dedicado à memória do falecido Dr. Zvi Selinger, que sediou a pesquisa original descreveu aqui.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Bradford reagent | Bio-Rad Laboratories | 500-0006 | ||
| Bovine Serum Albumin | Amersco | 0332 | ||
| Multiplate absorbance reader | BioTek | Synergy2 |
Riferimenti
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
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- Chial, H. J., Splittgerber, A. G. A comparison of the binding of Coomassie brilliant blue to proteins at low and neutral pH. Anal Biochem. 213, 362-369 (1993).
- Compton, S. J., Jones, C. G. Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay. Anal Biochem. 151, 369-374 (1985).
- Congdon, R. W., Muth, G. W., Splittgerber, A. G. The binding interaction of Coomassie blue with proteins. Anal Biochem. 213, 407-413 (1993).
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