Medaka och zebrafisk är kompletterande för genetisk dissektion av ryggradsdjur genomet funktioner. Detta protokoll belyser de viktigaste punkterna för en lyckad mikroinjektion i medaka embryon, en viktig teknik för embryologiska och genetisk analys med medaka och zebrafisk i ett laboratorium.
I denna video visar vi tekniken med mikroinjektion i en cell medaka skede embryon. Medaka är ett litet äggläggande sötvattensfisk som tillåter både genetiska och embryologiska analyser och är en av de ryggradsdjur modell organismer i vilka arvsmassan hela fenotyp driven mutant skärmar genomfördes 1, som i zebrafisk och musen. Avvikelse av funktionell överlappning av gener mellan medaka och zebrafisk möjliggör identifiering av nya fenotyper som är oidentifierbara i en enda art 2, vilket medaka och zebrafisk är kompletterande för genetisk dissektion av ryggradsdjur genomet funktioner.
För att dra nytta av medaka fisk vars embryon är transparenta och utvecklas externt, är mikroinjektion en viktig teknik för att injicera cell-spårämnen för märkning av celler, mRNA eller anti-känsla oligonukleotider för över-uttrycka och knackar ner gener av intresse och DNA för att göra transgena linjerna.
I denna video visar vi en metod för cell spårämne, mRNA, DNA eller anti-sense oligonukleotid injektion i en cell medaka skede embryon. Denna teknik har gett oss möjlighet att studera olika utvecklingsprocesser in vivo i realtid. Denna process, de därpå följande detaljerad analys det ger har potential att väsentligt öka vår förståelse av ryggradsdjur organogenesen och den underliggande cellbiologi. Sådan kunskap kan vara viktigt för, och ge terapeutiska tillämpningar inom regenerativ medicin.
Detta arbete stöddes av ett bidrag från MRC.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
4″ fine net | Tools | J & K Aquatics Ltd. | MD001 | Used to capture fish during egg harvesting. |
Embryo medium | Reagent | Made in-house | 200ml 50X stock solution, 1ml 1%methyleneblue in H2O/10 liter RO water (50X stock solution: NaCl 14.7g, KCl 0.6g, CaCl2 2H2O 2.4g, MgSO4 7H2O 4.0g/1 litre RO water. | |
Fine waterproof sandpaper – p2000 grit size | Tools | Hermes Abrasives Ltd. | Very fine grit size for rolling/cleaning embryos with chorions. | |
Borosilicate glass capillaries | Tool | Harvard Apparatus | GC100-10F | For making microinjection needles. |
Micropipette puller | Equipment | Narishige scientific instrument lab | Model PP-830 | For making microinjection needles. |
Eppendorf microloader | Tool | Eppendorf | 5242956.003 | For loading microinjection needles. |
Microinjector apparatus | Equipment | Eppendorf | Model 5242. | |
Micromanipulator | Equipment | Narishige | Model MN151. | |
Agarose injection plate | Tools | Made in-house | For holding embryos during injection. |