Sospensione colorazione immunocitochimica di cellule staminali umane pluripotenti (hPSCs) per la superficie cellulare marcatori (SSEA-3/SSEA-4) è stato raggiunto sulla base di utilizzo di un self-made apparato cytospin per creare un monostrato di cellule per l'osservazione e la quantificazione.
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Articolo metodologico
Analisi immunocitochimica di cellule staminali umane pluripotenti usando un Self-Made Apparato Cytospin
In questo articolo
Sommario
Abstract
Cellule staminali pluripotenti (hPSCs) che includono cellule staminali embrionali umane (hESC) e umani cellule staminali pluripotenti indotte (hiPSCs) sono fonti di cellule eccitante a causa della loro illimitata capacità di auto-rinnovamento e il loro potenziale di differenziarsi in tipi cellulari diversi. Lo stato pluripotente di hPSCs è tipicamente valutata mediante tecniche come qPCR, immunocitochimica, e da altri
Protocollo
Parte 1: Sospensione colorazione immunocitochimica
- Le cellule sono raccolte in una sospensione di cellule singole.
- Le cellule sono poi trasferiti in 1,5-microcentrifuga da 2 ml tubi e centrifugati a 200g per 4 minuti.
- Le cellule sono lavate aspirando fuori surnatante, risospesi in 1 ml di PBS - (senza Mg 2 + e Ca 2 +) e poi centrifugati nuovamente a 200g per 4 minuti. Questo dovrebbe essere fatto due volte.
- Dopo il lavaggio, le cellule vengono poi fissati dalla ri-sospensione in 1 ml di paraformaldeide 4% (PFA) a temperatura ambiente per 10 minuti.
- Le cellule sono lavate di nuovo per due volte c....
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Discussione
Ai fini del nostro laboratorio, un piatto di 35 mm di colture di cellule staminali coltivate su fibroblasti embrionali del mouse (MEF) è assegnato per la procedura di colorazione immunocitochimica per l'utilizzo con l'apparecchio cytospin. Le cellule sono poi raccolti tramite enzimatica passaging, eliminando quanto più dello strato MEF possibile, in una cella singola sospensione. Se è più efficace isolamento delle cellule staminali dallo strato MEF si desidera, le colonie possono essere raccolte manualmente poi .......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Finanziamento parziale per questo lavoro è stato fornito da NSF-CARRIERA 0744556 (Rao) e una borsa di studio attraverso il VCU-HHMI Scienze dell'educazione e della Research Program (Pascual).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Lab Tek Permanox Chamber Slide | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 117437 | Materiale per vetrini di plastica riutilizzati |
| Vetrini Microscopici Superfrost/Plus Precleaned | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Punte Filtranti 0.1-10μL | USA Scientific, Inc. | 1121-3810 | |
| Vetrocopri Microscopico | Fisher Scientific | 120542-B | |
| Cytoseal 280 | Richard-Allan Scientific | 8311-4 | Mezzo di montaggio |
| DPBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190 | |
| Serum di capra normale | Invitrogen | 10000C | |
| Anticorpo monoclonale Anti-SSEA-4 di topo | EMD Millipore | MAB4304 | Anticorpo primario per la colorazione SSEA-4 |
| Anticorpo monoclonale Anti-SSEA-3 di ratto | EMD Millipore | MAB4303 | Anticorpo primario per la colorazione SSEA-3 |
| Alexa Fluor 488 IgG di capra anti-topo | Invitrogen | A11029 | Anticorpo secondario per la colorazione SSEA-4 |
| IgG di capra anti-ratto marcato con Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11006 | Anticorpo secondario per la colorazione SSEA-3 |
| DAPI, cloridrato diidrico | Calbiochem | 268298 |
Riferimenti
- Rao, R. R., Johnson, A. V., Stice, S. L. Cell surface markers in human embryonic stem cells. Methods in Mol. Bio. - Stem Cell Assays. 407, 51-61 (2007).
- Sisino, G., Bellavia, D., Corallo, M., Geraci, F., Barbieri, R. A homemade cytospin apparatus. Anal. Biochem. 359, 283-284 (200....
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Ristampe e permessi
