Extraheren van DNA uit de Gut Microben van de Termite (Zootermopsis Angusticollis) en visualiseren Gut microben
Summary
Deze video illustreert de techniek voor de extractie van DNA van de soorten van microben woonachtig zijn in de termiet einddarm. De voorbereiding van een natte glijbaan berg, wat handig is voor het visualiseren van de darm microbiële gemeenschap wordt ook geïllustreerd, en een rondleiding door het soortenrijke darm-omgeving wordt gegeven.
Abstract
Termieten zijn een van de weinige dieren waarvan bekend is dat de capaciteit om uitsluitend bestaan door de consumptie van hout hebben. De termiet darm kanaal bevat een dichte en soortenrijk microbiële populatie die bij de afbraak van lignocellulose helpt voornamelijk in acetaat, de belangrijkste voedingsstof brandstof termiet metabolisme (Odelson & Breznak, 1983). Binnen deze microbiële populaties zijn bacteriën, archaea methanogene en, in sommige ("lagere") termieten, eukaryote protozoa. Zo, termieten zijn excellent onderzoek onderwerpen voor het bestuderen van de interacties tussen microbiële species en de vele biochemische functies die ze vervullen in het belang van hun gastheer. De soortensamenstelling van de microbiële populaties in termietenheuvels darmen evenals de belangrijkste genen die betrokken zijn in verschillende biochemische processen is onderzocht met behulp van moleculaire technieken (Kudo et al., 1998;. Schmit-Wagner et al., 2003;. Salmassi & Leadbetter, 2003). Deze technieken zijn afhankelijk van de extractie en zuivering van hoge kwaliteit nucleïnezuren van de termiet darm-omgeving. De extractie techniek wordt beschreven in deze video is een gewijzigde samenstelling van protocollen ontwikkeld voor de extractie en zuivering van nucleïnezuren van het milieu monsters (Mor et al., 1994;. Berthelet et al., 1996;. Purdy et al., 1996;. Salmassi & Leadbetter, 2003;. Ottesen et al. 2006) en het produceert DNA van termiet einddarm materiaal dat geschikt is voor gebruik als sjabloon voor polymerase chain reaction (PCR).
Protocol
Discussion
In onze ervaring, DNA geëxtraheerd uit de microbiële gemeenschappen van het hout geeft termiet soorten zoals Zootermopis nevadensis is voldoende zuiver voor PCR-sjabloon na een ronde van de extractie en zuivering. Echter, sommige termieten, zoals zwerfvuil-voeding en bodem geeft soorten hebben een hogere concentratie van humuszuren in hun darminhoud en kunnen extra zuivering van darm microbiële DNA nodig hebben. De totale DNA-opbrengst van de ingewanden van 5 Z. nevadensis werknemers is in de range van 10-30 mg. Voor de termiet soorten a…
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| PVPP/SDS/phenol | Buffer | homogeneization buffer | ||
| DNeasy Tissue Kit | Kit | Qiagen | 77607 | Used according to the protocol for isolation of genomic DNA from crude lysates (Appendix H, product manual version: July 2003) |
| TE | Buffer | Sigma | T9285 | 1x buffer (1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0) from 100x concentrate |
| zirconia/silica beads | Supplies | BioSpec Products | 11079101z | 0.1 mm |
| PVPP | Reagent | Sigma | P6755 | 1% w/v polyvinylpolypyrrolidone prepared from dry reagent as a 1x suspension in TE buffer |
| Zootermopsis nevadensis | Animal | Termites | ||
| SDS | Reagent | Sigma | L4390 | Sodium dodecyl sulfate 20% soln. in water from dry reagent |
| Phenol | Reagent | Sigma | 77607 | TE-saturated, ~73% |
| MiniBeadbeater-8 | Tool | BioSpec Products | 963 | |
| BSS | Buffered Salt Solution, pH 7.2 | Formulation per liter: 2.5 g K2HPO4, 1.0 g KH2PO4, 1.6 g KCl, 1.4 g NaCl, 0.075 g CaCl, 1 g MgCl, and 10 mL of a 1M soln. of NaHCO3 | ||
| AxioPlan-2 | Microscope | Carl Zeiss, Inc. USA | Outfitted with 40x objective, 1.6x optivar and 10x ocular lenses. Samples were viewed using phase contrast illumination |
Riferimenti
- Berthelet, M., Whyte, L. G., Greer, C. W. Rapid, Direct Extraction of DNA from Soils for PCR Analysis using Polyvinylpolypyrrolidone Spin Columns. FEMS Microbiol. Lett. 138, 17-22 (1996).
- Kudo, T., Ohkuma, M., Moriya, S., Noda, S., Ohtoko, K. Molecular Phylogenetic Identification of the Intestinal Anaerobic Microbial Community in the Hindgut of the Termite, Reticulitermes Speratus, without Cultivation. Extremophiles. 2, 155-161 (1998).
- Moré, M. I., Herrick, J. B., Silva, M. C., Ghiorse, W. C., Madsen, E. L. Quantitative Cell Lysis of Indigenous Microorganisms and Rapid Extraction of Microbial DNA from Sediment. Appl. Environ. Microbiol. 60, 1572-1580 (1994).
- Odelson, D. A., Breznak, J. A. Volatile Fatty Acid Production by the Hindgut Microbiota of Xylophagous Termites. Appl. Environ. Microbiol. 45, 1602-1613 (1983).
- Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. Microfluidic Digital PCR Enables Multigene Analysis of individual Environmental Bacteria. Science. 314, 1464-1467 (2006).
- Purdy, K. J., Embley, T. M., Takii, S., Newdell, D. B. Rapid Extraction of DNA and rRNA from Sediments by a Novel Hydroxyapatite Spin-Column Method. Appl. Environ. Microbiol. 62, 3905-3907 (1996).
- Salmassi, T. M., Leadbetter, J. R. Analysis of Genes of Tetrahydrofolate-Dependent Metabolism from Cultivated Spirochaetes and the Gut Community of the Termite Zootermopsis Angusticollis. Microbiology. 149, 2529-2537 (2003).
- Schmitt-Wagner, D., Friedrich, M. W., Wagner, B., Brune, A. Phylogenetic Diversity, Abundance, and Axial Distribution of Bacteria in the Intestinal Tract of Two Soil-Feeding Termites (Cubitermes spp). Appl. Environ. Microbiol. 69, 6007-6017 (2003).
- Tsai, Y. L., Olson, B. H. Rapid Method for Separation of Bacterial DNA from Humic Substances in Sediments for Polymerase Chain Reaction. Appl. Environ. Microbiol. 58, 2292-2295 (1992).
