Termit Gut Mikroplar (Zootermopsis Angusticollis) DNA ayıklanıyor ve Gut Mikroplar görselleştirme
Summary
Bu video termit hindgut ikamet mikropların türünün DNA ayıklamak için teknik göstermektedir. Bağırsak mikrobiyal topluluk görüntülenmesi için yararlı bir ıslak montaj kaydırağı, hazırlık da gösterilmiştir ve türler açısından zengin bir bağırsak ortamı üzerinden bir tur verilir.
Abstract
Termitler sadece alıcı ahşap geçinmeye kapasitesine sahip olduğu bilinen en az sayıda hayvan arasında yer almaktadır. Termit bağırsak yolu, ağırlıklı olarak asetat lignoselüloz bozulması yardımcı, yoğun ve türler zengin bir mikrobiyal nüfusun bulunduğu, termit metabolizma alevlendiren kilit besin (Odelson & Breznak, 1983). ("Düşük") bazı termitler de ökaryotik protozoa, bakteri, metan arkelerin ve bu mikrobik popülasyonları içinde. Böylece, termitler mükemmel araştırma konuları mikrobiyal türler ve ev sahibi yararına yapmak birçok biyokimyasal fonksiyonları arasındaki etkileşimleri çalışmak için. Termit bağırsaklar gibi çeşitli biyokimyasal süreçlerde yer alan anahtar genlerin mikrobiyal popülasyonların tür bileşimi, moleküler teknikler kullanılarak (Schmit-Wagner ve ark, 2003; Salmassi & Leadbetter, 2003 Kudo ve ark, 1998) incelenmiştir. Bu teknikler, termit bağırsak ortamından yüksek kalitede nükleik asitlerin ekstraksiyonu ve saflaştırma bağlıdır. Berthelet ve ark, 1996; Purdy ve ark, 1996; Salmassi & Leadbetter Bu video açıklanan çıkarma tekniği çevre örnekleri (Mor ve ark, 1994 nükleik asitlerin ekstraksiyonu ve saflaştırılması için geliştirilen protokoller değiştirilmiş bir derleme 2003;. Ottesen ve ark 2006) ve DNA polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) için şablon olarak kullanmak için uygun termit hindgut malzeme üretir.
Protocol
Discussion
Bizim tecrübelerimize göre, Zootermopis nevadensis gibi ahşap besleme termit türlerinin mikrobiyal topluluklar çıkarılan DNA ekstraksiyonu ve saflaştırma bir turdan sonra, PCR şablon için yeterince saf. Ancak, çöp besleme ve toprak besleme türleri gibi bazı termitler, bağırsak içeriği hümik asit daha yüksek bir konsantrasyon ve bağırsak mikrobiyal DNA ek arıtma gerekebilir. Toplam 5 Z. nevadensis işçilerin cesareti DNA verimi 10-30 mikrogram aralığında. Önemli ölçüde daha küçük veya daha büyük bu türü…
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| PVPP/SDS/phenol | Buffer | homogeneization buffer | ||
| DNeasy Tissue Kit | Kit | Qiagen | 77607 | Used according to the protocol for isolation of genomic DNA from crude lysates (Appendix H, product manual version: July 2003) |
| TE | Buffer | Sigma | T9285 | 1x buffer (1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0) from 100x concentrate |
| zirconia/silica beads | Supplies | BioSpec Products | 11079101z | 0.1 mm |
| PVPP | Reagent | Sigma | P6755 | 1% w/v polyvinylpolypyrrolidone prepared from dry reagent as a 1x suspension in TE buffer |
| Zootermopsis nevadensis | Animal | Termites | ||
| SDS | Reagent | Sigma | L4390 | Sodium dodecyl sulfate 20% soln. in water from dry reagent |
| Phenol | Reagent | Sigma | 77607 | TE-saturated, ~73% |
| MiniBeadbeater-8 | Tool | BioSpec Products | 963 | |
| BSS | Buffered Salt Solution, pH 7.2 | Formulation per liter: 2.5 g K2HPO4, 1.0 g KH2PO4, 1.6 g KCl, 1.4 g NaCl, 0.075 g CaCl, 1 g MgCl, and 10 mL of a 1M soln. of NaHCO3 | ||
| AxioPlan-2 | Microscope | Carl Zeiss, Inc. USA | Outfitted with 40x objective, 1.6x optivar and 10x ocular lenses. Samples were viewed using phase contrast illumination |
Riferimenti
- Berthelet, M., Whyte, L. G., Greer, C. W. Rapid, Direct Extraction of DNA from Soils for PCR Analysis using Polyvinylpolypyrrolidone Spin Columns. FEMS Microbiol. Lett. 138, 17-22 (1996).
- Kudo, T., Ohkuma, M., Moriya, S., Noda, S., Ohtoko, K. Molecular Phylogenetic Identification of the Intestinal Anaerobic Microbial Community in the Hindgut of the Termite, Reticulitermes Speratus, without Cultivation. Extremophiles. 2, 155-161 (1998).
- Moré, M. I., Herrick, J. B., Silva, M. C., Ghiorse, W. C., Madsen, E. L. Quantitative Cell Lysis of Indigenous Microorganisms and Rapid Extraction of Microbial DNA from Sediment. Appl. Environ. Microbiol. 60, 1572-1580 (1994).
- Odelson, D. A., Breznak, J. A. Volatile Fatty Acid Production by the Hindgut Microbiota of Xylophagous Termites. Appl. Environ. Microbiol. 45, 1602-1613 (1983).
- Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. Microfluidic Digital PCR Enables Multigene Analysis of individual Environmental Bacteria. Science. 314, 1464-1467 (2006).
- Purdy, K. J., Embley, T. M., Takii, S., Newdell, D. B. Rapid Extraction of DNA and rRNA from Sediments by a Novel Hydroxyapatite Spin-Column Method. Appl. Environ. Microbiol. 62, 3905-3907 (1996).
- Salmassi, T. M., Leadbetter, J. R. Analysis of Genes of Tetrahydrofolate-Dependent Metabolism from Cultivated Spirochaetes and the Gut Community of the Termite Zootermopsis Angusticollis. Microbiology. 149, 2529-2537 (2003).
- Schmitt-Wagner, D., Friedrich, M. W., Wagner, B., Brune, A. Phylogenetic Diversity, Abundance, and Axial Distribution of Bacteria in the Intestinal Tract of Two Soil-Feeding Termites (Cubitermes spp). Appl. Environ. Microbiol. 69, 6007-6017 (2003).
- Tsai, Y. L., Olson, B. H. Rapid Method for Separation of Bacterial DNA from Humic Substances in Sediments for Polymerase Chain Reaction. Appl. Environ. Microbiol. 58, 2292-2295 (1992).
