כימות γH2AX מוקדים בתגובה קרינה Ionising
Summary
כימות של גדיל הדנ"א הכפול פסים באמצעות היווצרות γH2AX כסמן המולקולרית הפכה כלי רב ערך בביולוגיה קרינה. כאן אנו מדגימים את השימוש assay immunofluorescence עבור כימות γH2AX מוקדים לאחר חשיפה לקרינה של תאים.
Abstract
גדיל הדנ"א הכפול הפסקות (DSBs), אשר המושרה על ידי או תהליכים מטבוליים אנדוגני או על ידי מקורות חיצוניים, הם אחד נגעים DNA הקריטי ביותר מבחינת הישרדות ושמירה על שלמות הגנומי. תגובה מוקדמת לזירוז של DSBs הוא זירחון של הגרסה H2A היסטון, H2AX, על שאריות סרין-139, את מוטיב שמור ביותר SQEY בטרמינל C-, להרכיב γH2AX<sup> 1</sup>. בעקבות אינדוקציה של DSBs, H2AX הוא phosphorylated במהירות על ידי phosphatidyl inosito-3-kinase (PIKK) משפחה של חלבונים, אטקסיה telangiectasia מוטציה (ATM), ה-DNA למקטע החלבון קינאז קטליטי ATM ו RAD3 הקשורות (ATR)<sup> 2</sup>. בדרך כלל, רק מעטים בסיס זוגות (נ"ב) הם מעורבים DSB, לעומת זאת, יש הגברה איתות משמעותי, לאור החשיבות של שינויים הכרומטין איתות DNA נזק ותיקון. זירחון של H2AX מתווכת בעיקר באמצעות כספומט מתפשטת באזורים סמוכים של הכרומטין, המשפיעים על כ 0.03% בסך הכל סלולרי H2AX לכל DSB<sup> 2,3</sup>. זה מתאים זירחון של כ 2000 מולקולות H2AX פורש ~ 2 אזורים MBP של הכרומטין סביב האתר של DSB והתוצאות היווצרות של בדידות γH2AX מוקדים אשר ניתן דמיינו בקלות ונרשמת ידי מיקרוסקופית immunofluorescence<sup> 2</sup>. אובדן γH2AX ב DSB משקף לתקן זאת, קיימת מחלוקת מסוימת לגבי מה מגדיר תיקון מלא של DSBs, הוצע כי הצטרפותו המחודשת של שני גדילי הדנ"א היא נאותה עם זאת, יש גם הציע מחדש instatement של מצב הכרומטין המקורי של הדחיסה הוא הכרחי<sup> 4-8</sup>. Disappearence של γH2AX כוללת לפחות בחלקה, על ידי dephosphorylation phosphatases, phosphatase 2A ו phosphatase 4C<sup> 5,6</sup>. יתרה מזאת, הסרת γH2AX על ידי חלוקה מחדש מעורבים חילופי היסטון עם H2A.Z היה מעורב<sup> 7,8</sup>. חשוב לציין כי ניתוח כמותי של מוקדי γH2AX הובילה למגוון רחב של יישומים בתחום המחקר הרפואי גרעיני. הנה, אנחנו מדגימים את השיטה immunofluorescence הנפוץ ביותר להערכת נזק לדנ"א הראשוני על ידי איתור של quantitation γH2AX מוקדים ב-γ מוקרן קרטינוציטים אדם חסיד<sup> 9</sup>.
Protocol
Discussion
בעקבות חשיפה לקרינה מייננת (קרני ה-γ), γH2AX טופס מוקדים במהירות ומספרי מוקדים להגיע למקסימום בין 30-60 דקות 2. לכן, 1 שלנו שלאחר הקרנת שעה נקודת זמן משקפת הראשונית היווצרות DSB. השתמשנו הקרינה רלוונטיות קלינית של 2 Gy לצורך הניסוי שלנו. עם זאת, השיטה ניתן להשתמש במינון קר…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
התמיכה של המכון האוסטרלי גרעיני מדע והנדסה הוא הודה. TCK היה זכה בפרסים AINSE. המעבדה לרפואה epigenomic נתמכת הבריאות הלאומי המועצה למחקר רפואי של אוסטרליה (566,559). LM נתמך על ידי מלבורן מחקר (אוניברסיטת מלבורן) ו ביו הדמיה מלגות CRC משלים. התמיכה של מונש Micro Imaging (ד"ר סטיבן קודי ואת היתר קרמייקל) היה שלא יסולא בפז עבור עבודה זו.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Keratinocyte-Serum Free Medium (K-SFM) | Media | Invitrogen | 17005042 | Keratinocyte media supplemented with human recombinant Epidermal Growth Factor 1-53 (EGF 1-53), and Bovine Pituitary Extract (BPE). |
| Lab Tek lI Chamber Slides (8-well) | Chamber Slides | Nunc Denmark | NUN154534 | |
| Coverslips (22x50mm) | Coverslips | Menzel-Gläser | CS2250100 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA. | |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| 0.5% Trypsin-EDTA x10 | Invitrogen | 15400-054 | Trypsin-EDTA (0.05%) used to detach cells from culture flasks. | |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells. |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | 158127 | Paraformaldehyde (4%) used to fix cells. |
| Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody | Primary Antibody | Millipore | 16193 | Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen | 11029 | Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| TOPRO3 | DNA Stain | Invitrogen | T3605 | DNA stain commonly used: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Can only be used with microscopes with the appropriate excitation laser. |
| ProLong Gold | Anti-fade solution | Invitrogen | P36930 | Refractive index of 1.42 at 20°C. |
| Tissue Culture Flask, Vented Cap | Culture Flask | BD Falcon | 353112 | |
| Tissue Culture Dish (150x25mm) | Petridish | BD Falcon | 353025 | |
| Coplin Jar, glass | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| Staining Trough | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| Gammacell 1000 Elite Irradiator | Gamma Irradiator | Nordion International Inc. | ||
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal | Confocal Microscope | |||
| Metamorph | Software for Imaging analysis | Molecular Devices, USA |
References
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
- Bonner, W. M. Gamma H2AX and cancer. Nature Reviews Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).
- Savic, V. Formation of Dynamic [gamma]-H2AX Domains along Broken DNA Strands Is Distinctly Regulated by ATM and MDC1 and Dependent upon H2AX Densities in Chromatin. Molecular Cell. 34 (3), 298-310 (2009).
- Downs, J. Binding of chromatin-modifying activities to phosphorylated histone H2A at DNA damage sites. Mol Cell. 16 (6), 979-990 (2004).
- Chowdhury, D. [gamma]-H2AX Dephosphorylation by Protein Phosphatase 2A Facilitates DNA Double-Strand Break Repair. Molecular Cell. 20 (5), 801-809 (2005).
- Nakada, S., Chen, G., Gingras, A., Durocher, D. PP4 is a gamma H2AX phosphatase required for recovery from the DNA damage checkpoint. EMBO Rep. 9 (10), 1019-1026 (2008).
- Altaf, M., Auger, A., Covic, M., Côté, J. Connection between histone H2A variants and chromatin remodeling complexes. Biochem Cell Biol. 87 (1), 35-50 (2009).
- Kusch, T. Acetylation by Tip60 Is Required for Selective Histone Variant Exchange at DNA Lesions. Science. 306, 2084-2087 (2004).
- Hurlin, P. Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (2), 570-574 (1991).
- Dickey, J. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. , (2009).
