Kvantifiering av γH2AX Foci som svar på joniserande strålning
Summary
Kvantifiering av DNA dubbel-strängen strimmor med γH2AX bildas som en molekylär markör har blivit ett ovärderligt verktyg i strålningsbiologi. Här har vi demonstrera användningen av ett immunofluorescens test för kvantifiering av γH2AX härdar efter exponering av celler för strålning.
Abstract
DNA dubbel-strängbrott (DSBs), som induceras av antingen endogena metaboliska processer eller av exogena källor, är en av de mest kritiska DNA-skador med avseende på överlevnad och bevarande av genetiska integritet. En tidig reaktion på induktion av DSBs är fosforyleringen av H2A histon varianten, H2AX på serin-139 rester, i starkt konservativa C-terminal SQEY motiv, bildar γH2AX<sup> 1</sup>. Efter induktion av DSBs är H2AX snabbt fosforyleras av det fosfatidyl-inosito 3-kinas (Pikk) familj av proteiner, ataxi telangiectasia muterad (ATM), DNA-protein kinas katalytiska subenheten och ATM och RAD3-relaterade (ATR)<sup> 2</sup>. Normalt är bara några baspar (bp) inblandad i ett DSB, finns det dock betydande signalförstärkning, med tanke på vikten av kromatin förändringar i DNA-skador signalering och reparation. Fosforylering av H2AX medieras huvudsakligen av ATM sprider sig till angränsande områden i kromatin, som drabbar ungefär 0,03% av det totala cellulära H2AX per DSB<sup> 2,3</sup>. Detta motsvarar fosforylering av ungefär 2000 H2AX molekyler som spänner över ~ 2 MBP regioner i kromatin som omger platsen för DSB och leder till bildandet av diskreta γH2AX foci som lätt kan visualiseras och kvantifieras genom immunofluorescens mikroskopi<sup> 2</sup>. Förlusten av γH2AX på DSB speglar reparation, finns det dock viss oenighet om vad som definierar fullständig reparation av DSBs, det har föreslagits att återförening av båda delar av DNA är tillräcklig har det dock också föreslagits att återinförande av ursprungliga kromatin tillstånd packning är nödvändig<sup> 4-8</sup>. Den försvinnande av γH2AX involverar åtminstone delvis, defosforylationen genom fosfataser, fosfatas 2A och fosfatas 4C<sup> 5,6</sup>. Vidare har avskaffandet av γH2AX genom omfördelning innebär histon utbyte med H2A.Z varit inblandad<sup> 7,8</sup>. Viktigare är den kvantitativa analysen av γH2AX foci lett till ett brett spektrum av tillämpningar inom medicinsk och kärnforskning. Här visar vi de vanligaste immunofluorescens metod för utvärdering av första DNA-skador genom detektion och kvantifiering av γH2AX foci i γ-bestrålade anhängare mänskliga keratinocyter<sup> 9</sup>.
Protocol
Discussion
Efter exponering för joniserande strålning (γ-strålar), γH2AX fokus formen snabbt och fokus siffror uppgå till högst mellan 30-60 minuter 2. Därför speglar vår 1 timme efterbestrålning tidpunkt första DSB bildas. Vi har använt kliniskt relevant stråldosen av 2 Gy för vårt experiment. Däremot kan metoden användas för stråldoser upp till 4 Gy för detektering av första DSB utformning; betydande överlappning av foci utesluter exakt kvantifiering vid högre doser. Högre stråldoser kan anv?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Stödet från Australian Institute of Nuclear Science and Engineering är erkänd. TCK var mottagare av AINSE utmärkelser. Epigenomiska Medicin Lab stöds av det nationella hälso-och medicinska forskningsrådet i Australien (566.559). LM stöds av Melbourne Research (University of Melbourne) och biomedicinsk avbildning CRC stipendier kompletterande. Stödet från Monash Micro Imaging (DRS Stephen Cody och ISKA Carmichael) var ovärderlig för detta arbete.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Keratinocyte-Serum Free Medium (K-SFM) | Media | Invitrogen | 17005042 | Keratinocyte media supplemented with human recombinant Epidermal Growth Factor 1-53 (EGF 1-53), and Bovine Pituitary Extract (BPE). |
| Lab Tek lI Chamber Slides (8-well) | Chamber Slides | Nunc Denmark | NUN154534 | |
| Coverslips (22x50mm) | Coverslips | Menzel-Gläser | CS2250100 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA. | |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| 0.5% Trypsin-EDTA x10 | Invitrogen | 15400-054 | Trypsin-EDTA (0.05%) used to detach cells from culture flasks. | |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells. |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | 158127 | Paraformaldehyde (4%) used to fix cells. |
| Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody | Primary Antibody | Millipore | 16193 | Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen | 11029 | Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| TOPRO3 | DNA Stain | Invitrogen | T3605 | DNA stain commonly used: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Can only be used with microscopes with the appropriate excitation laser. |
| ProLong Gold | Anti-fade solution | Invitrogen | P36930 | Refractive index of 1.42 at 20°C. |
| Tissue Culture Flask, Vented Cap | Culture Flask | BD Falcon | 353112 | |
| Tissue Culture Dish (150x25mm) | Petridish | BD Falcon | 353025 | |
| Coplin Jar, glass | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| Staining Trough | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| Gammacell 1000 Elite Irradiator | Gamma Irradiator | Nordion International Inc. | ||
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal | Confocal Microscope | |||
| Metamorph | Software for Imaging analysis | Molecular Devices, USA |
References
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
- Bonner, W. M. Gamma H2AX and cancer. Nature Reviews Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).
- Savic, V. Formation of Dynamic [gamma]-H2AX Domains along Broken DNA Strands Is Distinctly Regulated by ATM and MDC1 and Dependent upon H2AX Densities in Chromatin. Molecular Cell. 34 (3), 298-310 (2009).
- Downs, J. Binding of chromatin-modifying activities to phosphorylated histone H2A at DNA damage sites. Mol Cell. 16 (6), 979-990 (2004).
- Chowdhury, D. [gamma]-H2AX Dephosphorylation by Protein Phosphatase 2A Facilitates DNA Double-Strand Break Repair. Molecular Cell. 20 (5), 801-809 (2005).
- Nakada, S., Chen, G., Gingras, A., Durocher, D. PP4 is a gamma H2AX phosphatase required for recovery from the DNA damage checkpoint. EMBO Rep. 9 (10), 1019-1026 (2008).
- Altaf, M., Auger, A., Covic, M., Côté, J. Connection between histone H2A variants and chromatin remodeling complexes. Biochem Cell Biol. 87 (1), 35-50 (2009).
- Kusch, T. Acetylation by Tip60 Is Required for Selective Histone Variant Exchange at DNA Lesions. Science. 306, 2084-2087 (2004).
- Hurlin, P. Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (2), 570-574 (1991).
- Dickey, J. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. , (2009).
