자기편 및 비 점착 성의 포유 동물 세포의 현장 Subcellular 분별 (분리)에서
Summary
현미경 coverslips에서 포유 동물 세포의 현장 subcellular 분별 (분리)에서 단백질 지방화의 시각이 있습니다.
Abstract
단백질 기능을 속속들이 단백질 현지화로 결합됩니다. 어떤 단백질은 특정 위치 또는 subcellular 구획로 제한하고 있지만, 많은 단백질이 밀접하게 특정 subcellular 도메인 또는 구조와 관련된 하위 인구를 무료로 교환 자유롭게 diffusing 인구로 존재한다. 원위치 subcellular 분별 (분리)에서의 시각화가 가능 단백질 compartmentalization 또한 단백질 구체적인 구조에 집중 하위 인구를 공개하실 수 있습니다. 예를 들어, 용해 세포질 단백질과 느슨하게 개최 핵 단백질의 제거는 염색질와 함께 전사 요소의 안정적인 연결을 확인할 수 있습니다. DNA의 소화 이후 어떤 경우에는 집합 핵 발판이나 핵 매트릭스를 칭했다는 단백질과 RNAS의 네트워크 연결을 확인할 수 있습니다.
여기 현미경 coverslips에 자기편 및 비 점착 성의 포유 동물 세포의 현장 분별화에서 중 필요한 단계를 설명합니다. 단백질 시각화는 특정 항체 또는 형광 융합 단백질과 형광 현미경을 사용하여 얻을 수 있습니다. 항체 및 / 또는 특정 구획이나 구조에 대한 마커 역할을 형광 염료는 단백질 지방화는 자세히 매핑 될 수 있습니다. 원위치 분별화에서도 서양 각 분획에있는 단백질의 양을 비교 모래 바닥과 함께하실 수 있습니다. 이 간단한 생화 학적 접근 방법은 별도로 들키지 않고 남아있는 것이 연결을 확인할 수 있습니다.
Protocol
Discussion
일반적인 문제 및 제안 :
전부 또는 세포의 대부분은 세척하는 동안 손실됩니다. 세척 단계를하는 동안 액체는 coverslip을 피하 6 잘 접시의 측면으로 천천히 추가해야합니다. 마찬가지로 액체는 신중하게 틸팅 판에 의해 제거되어야하며 천천히 초과 액체를 pipetting. 세포 접착은 폴리 – L – 라이신 코팅 coverslips을 사용하여 증가 수 있습니다.
게놈 DNA가 완전?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Anyaporn Sawasdichai 및 Nazefah 압둘 하미드는 박사에 대한 각각 로얄 태국 정부와 말레이시아 정부에 감사 장학금. 이 작품은 PSJ와 KG에게 수여 웰컴 트러스트 프로젝트 부여하여 자금을했습니다. 우리는 또한 브리스톨 울프슨의 Bioimaging 시설의 대학에 감사하고 있습니다.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| BSA | Chemical | Sigma | A9647-100G | |
| DNase I | Chemical | Sigma | DN25-1G | |
| poly-L-Lysine | Chemical | Sigma | P-8920 | |
| Trypsin | Chemical | |||
| EGTA | Chemical | Sigma | E4378-25G | |
| Fomaldehyde | Chemical | BDH | 284216N | |
| PIPES | Chemical | Sigma | P-6757 | |
| Sucrose | Chemical | Fisher Scientific | S/8600/53 | |
| Triton X-100 | Chemical | Sigma | T-6876 | |
| Mounting Medium with DAPI | Chemical | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Fugene 6 Transfection Reagent | Chemical | Roche | 11814443001 | |
| Histone H1 | Antibodies | Santa Cruz | SC-8030 | |
| Lamin A/C | Antibodies | Santa Cruz | SC-20681 | |
| Tubulin-α | Antibodies | Santa Cruz | SC-32293 |
Riferimenti
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