في تقطير التحت خلوية الموقع من خلايا الثدييات وغير ملتصقة منتسب -
Summary
في الوضع الطبيعي للتجزيء التحت خلوية خلايا الثدييات على coverslips المجهر يسمح التصور من توطين البروتين.
Abstract
ويقترن ثيقا لتوطين وظيفة البروتين البروتين. على الرغم من تقييد بعض البروتينات لموقع معين أو مقصورة التحت خلوية ، العديد من البروتينات موجودة في عدد السكان نشرها بحرية في التبادل الحر مع مجموعة من السكان دون أن يرتبط بشكل وثيق مع ملك التحت خلوية معينة أو هيكل في تجزيء التحت خلوية الموقع يسمح التصور من ويمكن تقسيم البروتين تكشف أيضا البروتين الفرعي لتوطين السكان الذين هياكل محددة. على سبيل المثال ، يمكن إزالة بروتينات هيولي قابلة للذوبان والبروتينات النووية التي عقدت رابطة فضفاضة تكشف مستقرة لبعض عوامل النسخ مع لونين. يمكن هضم لاحقة من الحمض النووي في بعض الحالات تكشف بالتعاون مع شبكة من البروتينات والرناوات التي تسمى مجتمعة سقالة النووية أو مصفوفة النووية.
نحن هنا وصف الخطوات المطلوبة خلال تجزيء في الوضع الطبيعي للخلايا الثدييات وغير ملتصقة ملتصقة على اساس coverslips المجهر. ويمكن تحقيق التصور البروتين باستخدام أجسام مضادة معينة أو البروتينات الفلورية والانصهار المجهري مضان. الأضداد و / أو الأصباغ الفلورية والتي تكون بمثابة علامات للمقصورات محددة أو هياكل تسمح ليتم تعيينها توطين البروتين بالتفصيل. تجزيء في الموقع ويمكن أيضا أن يقترن الغربية النشاف لمقارنة كميات من البروتين موجودة في كل جزء. ويمكن هذا النهج بسيطة تكشف البيوكيميائية الجمعيات التي لم يتم كشفها إلا ستبقى.
Protocol
Discussion
مشترك المشاكل والاقتراحات :
وفقدت كل أو معظم الخلايا أثناء الغسل. ويجب غسل خلال الخطوات تضاف السوائل ببطء الى جانب لوحة 6 – جيدا تجنب ساترة. وبالمثل ، ينبغي إزالة السوائل من خلال إمالة لوحة pipetting بعناية وببطء قبالة السوائل الزائدة. و?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Anyaporn Sawasdichai وNazefah عبد الحميد ممتنون للحكومة التايلاندية الملكية وحكومة ماليزيا على التوالي للحصول على الدكتوراه المنح الدراسية. وقد تم تمويل هذا العمل من خلال منحة ويلكوم ترست منحت لمشروع PSJ والروضة. ونحن ممتنون أيضا لجامعة بريستول مرفق Bioimaging ولفسون.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| BSA | Chemical | Sigma | A9647-100G | |
| DNase I | Chemical | Sigma | DN25-1G | |
| poly-L-Lysine | Chemical | Sigma | P-8920 | |
| Trypsin | Chemical | |||
| EGTA | Chemical | Sigma | E4378-25G | |
| Fomaldehyde | Chemical | BDH | 284216N | |
| PIPES | Chemical | Sigma | P-6757 | |
| Sucrose | Chemical | Fisher Scientific | S/8600/53 | |
| Triton X-100 | Chemical | Sigma | T-6876 | |
| Mounting Medium with DAPI | Chemical | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Fugene 6 Transfection Reagent | Chemical | Roche | 11814443001 | |
| Histone H1 | Antibodies | Santa Cruz | SC-8030 | |
| Lamin A/C | Antibodies | Santa Cruz | SC-20681 | |
| Tubulin-α | Antibodies | Santa Cruz | SC-32293 |
Riferimenti
- Donaldson, M. M., Boner, W., Morgan, I. M. TopBP1 regulates human papillomavirus type 16 E2 interaction with chromatin. J Virol. 81, 4338-4342 (2007).
- Javed, A., Guo, B., Hiebert, S., Choi, J. Y., Green, J., Zhao, S. C., Osborne, M. A., Stifani, S., Stein, J. L., Lian, J. B., van Wijnen, A. J., Stein, G. S. Groucho/TLE/R-esp proteins associate with the nuclear matrix and repress RUNX (CBF(alpha)/AML/PEBP2(alpha)) dependent activation of tissue-specific gene transcription. J Cell Sci. 113, 2221-2231 (2000).
- Kowalczyk, A. M., Roeder, G. E., Green, K., Stephens, D. J., Gaston, K. Measuring the induction or inhibition of apoptosis by HPV proteins. Methods Mol. Med. 119, 419-432 (2005).
- McLarren, K. W., Theriault, F. M., Stifani, S. Association with the nuclear matrix and interaction with Groucho and RUNX proteins regulate the transcription repression activity of the basic helix loop helix factor Hes1. J Biol. Chem. 276, 1578-1584 (2001).
- McNeil, S., Guo, B., Stein, J. L., Lian, J. B., Bushmeyer, S., Seto, E., Atchison, M. L., Penman, S., van Wijnen, A. J., Stein, G. S. Targeting of the YY1 transcription factor to the nucleolus and the nuclear matrix in situ: the C-terminus is a principal determinant for nuclear trafficking. J Cell Biochem. 68, 500-510 (1998).
- Melan, M. A., Sluder, G. Redistribution and differential extraction of soluble proteins in permeabilized cultured cells. Implications for immunofluorescence microscopy. J Cell Sci. 101, 731-743 (1992).
- Zou, N., Lin, B. Y., Duan, F., Lee, K. Y., Jin, G., Guan, R., Yao, G., Lefkowitz, E. J., Broker, T. R., Chow, L. T. The hinge of the human papillomavirus type 11 E2 protein contains major determinants for nuclear localization and nuclear matrix association. J. Virol. 74, 3761-3770 (2000).
