ב ההיפוך חלוקה subcellular באתרו של בתאי יונקים חסיד שאינן חסיד
Summary
ב חלוקה subcellular באתרו של בתאי יונקים על coverslips מיקרוסקופ מאפשר הדמיה של לוקליזציה חלבון.
Abstract
תפקוד החלבון מצמידים הדוק לוקליזציה חלבון. למרות שחלק חלבונים מוגבלים במיקום מסוים או תא subcellular, חלבונים רבים נמצאים כאוכלוסייה לשדר באופן חופשי בתמורה חופשי עם האוכלוסייה משנה הקשור באופן הדוק עם תחום מבנה subcellular מסוים. חלוקה ב subcellular באתרו מאפשרת ויזואליזציה של חלבון מידור יכול גם לגלות חלבון תת אוכלוסיות למקם מבנים ספציפיים. למשל, הסרת חלבונים מסיסים cytoplasmic וחלבונים גרעיני שנערך רופף יכול לחשוף את הקשר היציב של כמה גורמי שעתוק עם הכרומטין. לאחר העיכול של דנ"א יכולה במקרים מסוימים לחשוף בשיתוף עם רשת של חלבונים RNAs אשר נקרא קולקטיבי הפיגום גרעיני או מטריצה גרעיני.
כאן אנו מתארים את השלבים הנדרשים במהלך של חלוקה באתרו של בתאי יונקים חסיד ולא חסיד על coverslips מיקרוסקופ. ויזואליזציה חלבון יכולה להיות מושגת באמצעות נוגדנים ספציפיים או חלבונים היתוך ניאון מיקרוסקופ פלואורסצנטי. נוגדנים ו / או צבעי ניאון כי לשמש סמנים של תאים או מבנים ספציפיים לאפשר לוקליזציה חלבון למפות בפירוט. חלוקה ב באתרו ניתן גם לשלב עם המערבי סופג להשוות את כמויות החלבון הנמצאים בכל חלק. גישה זו ביוכימי פשוט יכול לחשוף עמותות שאחרת להישאר מבלי שיבחינו בו.
Protocol
Discussion
בעיות נפוצות והצעות:
כל או רוב התאים הם איבדו במהלך הכביסה. במהלך השלבים כביסה נוזלים יש להוסיף באיטיות לצד צלחת 6-היטב את הימנעות coverslip. כמו כן נוזלים יש להסיר על ידי הטיית הצלחת בזהירות ולאט לאט pipetting את הנוזלים העודפים. הידבקות התא…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Anyaporn Sawasdichai ו Nazefah עבדול חמיד מודים לממשלת רויאל תאילנדי ממשלת מלזיה בהתאמה Ph.D. מלגות. עבודה זו מומנה על ידי קרן Wellcome הפרויקט להעניק הוענק PSJ ו KG. אנחנו גם מודה לאוניברסיטת מתקן bioimaging וולפסון בריסטול.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| BSA | Chemical | Sigma | A9647-100G | |
| DNase I | Chemical | Sigma | DN25-1G | |
| poly-L-Lysine | Chemical | Sigma | P-8920 | |
| Trypsin | Chemical | |||
| EGTA | Chemical | Sigma | E4378-25G | |
| Fomaldehyde | Chemical | BDH | 284216N | |
| PIPES | Chemical | Sigma | P-6757 | |
| Sucrose | Chemical | Fisher Scientific | S/8600/53 | |
| Triton X-100 | Chemical | Sigma | T-6876 | |
| Mounting Medium with DAPI | Chemical | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Fugene 6 Transfection Reagent | Chemical | Roche | 11814443001 | |
| Histone H1 | Antibodies | Santa Cruz | SC-8030 | |
| Lamin A/C | Antibodies | Santa Cruz | SC-20681 | |
| Tubulin-α | Antibodies | Santa Cruz | SC-32293 |
Riferimenti
- Donaldson, M. M., Boner, W., Morgan, I. M. TopBP1 regulates human papillomavirus type 16 E2 interaction with chromatin. J Virol. 81, 4338-4342 (2007).
- Javed, A., Guo, B., Hiebert, S., Choi, J. Y., Green, J., Zhao, S. C., Osborne, M. A., Stifani, S., Stein, J. L., Lian, J. B., van Wijnen, A. J., Stein, G. S. Groucho/TLE/R-esp proteins associate with the nuclear matrix and repress RUNX (CBF(alpha)/AML/PEBP2(alpha)) dependent activation of tissue-specific gene transcription. J Cell Sci. 113, 2221-2231 (2000).
- Kowalczyk, A. M., Roeder, G. E., Green, K., Stephens, D. J., Gaston, K. Measuring the induction or inhibition of apoptosis by HPV proteins. Methods Mol. Med. 119, 419-432 (2005).
- McLarren, K. W., Theriault, F. M., Stifani, S. Association with the nuclear matrix and interaction with Groucho and RUNX proteins regulate the transcription repression activity of the basic helix loop helix factor Hes1. J Biol. Chem. 276, 1578-1584 (2001).
- McNeil, S., Guo, B., Stein, J. L., Lian, J. B., Bushmeyer, S., Seto, E., Atchison, M. L., Penman, S., van Wijnen, A. J., Stein, G. S. Targeting of the YY1 transcription factor to the nucleolus and the nuclear matrix in situ: the C-terminus is a principal determinant for nuclear trafficking. J Cell Biochem. 68, 500-510 (1998).
- Melan, M. A., Sluder, G. Redistribution and differential extraction of soluble proteins in permeabilized cultured cells. Implications for immunofluorescence microscopy. J Cell Sci. 101, 731-743 (1992).
- Zou, N., Lin, B. Y., Duan, F., Lee, K. Y., Jin, G., Guan, R., Yao, G., Lefkowitz, E. J., Broker, T. R., Chow, L. T. The hinge of the human papillomavirus type 11 E2 protein contains major determinants for nuclear localization and nuclear matrix association. J. Virol. 74, 3761-3770 (2000).
