Afleiding van Mouse trofoblast stamcellen uit blastocysten

Summary

In deze video, tonen we de isolatie van de muis blastocysten en de afleiding van trofoblast stamcellen uit blastocysten. We beschrijven ook de voorwaarden voor het onderhoud van de stamcel terrein en in de inductie van differentiatie in cultuur.

Abstract

Specificatie van de trophectoderm is een van de eerste differentiatie gebeurtenissen van zoogdieren ontwikkeling. De trofoblast lijn afkomstig van de trophectoderm bemiddelt implantatie en genereert de foetale deel van de placenta. Als gevolg hiervan, de ontwikkeling van deze lijn is van essentieel belang voor de overleving van embryo's. Afleiding van trofoblast stam (TS) cellen van muizen blastocysten werd voor het eerst beschreven door Tanaka<em> Et al..</em> 1998. Het vermogen van TS cellen aan de trofoblast specifieke eigenschap en hun expressie van het podium-en celtype-specifieke merkers te behouden na een goede stimulatie biedt een waardevol model systeem om trofoblast lineage ontwikkeling te onderzoeken, waarbij indient vroege placentatie evenementen. Verder trofoblast cellen zijn een van de weinige somatische celtypen ondergaat natuurlijke genoom versterking. Hoewel de moleculaire pathways onderliggende trofoblast polyploidization zijn begonnen te ontrafelen, de fysiologische rol en profiteer van trofoblast genoom versterking blijft grotendeels ongrijpbaar. De ontwikkeling van diploïde stamcellen in polyploïde trofoblast cellen in cultuur maakt dit<em> Ex vivo</em> Systeem een ​​uitstekend hulpmiddel voor het ophelderen van het reguleringsmechanisme van genoom replicatie en instabiliteit in gezondheid en ziekte. Hier beschrijven we een protocol op basis van eerdere rapporten met wijzigingen gepubliceerd in Chiu<em> Et al..</em> 2008.

Protocol

In dit protocol beschrijven we de voorbereiding van de muis blastocysten en de vestiging van TS cellijnen. Algemeen muis manipulaties voorafgaand aan het verzamelen van blastocysten, waaronder de instelling voor natuurlijke bevruchting en de inductie van de super ovulatie, in principe volgen de standaard protocol geïllustreerd door Nagy et al.. 2003 (pp146-150). Afleiding en het onderhoud van de TS-cellen Setup fokken kruising tussen muizen van belang. Bereid j…

Discussion

In deze video, tonen we het proces om E3.5 blastocysten van baarmoeders en experimentele procedures verzamelen om TS cellijnen vast te stellen. We beschrijven ook de voorwaarde om de stemness van TS cellen te handhaven en hun differentiatie te induceren in de gedifferentieerde cellen. Twee cruciale stappen om pure TS cellijnen te verkrijgen zijn de timing voor de uitgroei disaggregatie (stap 9) en de verwerking van de eerste passage (stap 11). Het is gemeld dat de primitieve endoderm-afgeleide cellen kunnen voordoen in …

Materials

Reagents

TS medium:
RPMI-1640, 20% FBS, 1 mM sodium pyruvate, 100 mM beta-mercaptoethanol and 100 mg/ml penicillin-streptomycin.

Mitomycin C:
Dissolve 2 mg mitomycin C (Sigma M-0503) in 2 ml PBS and add this 2 ml mixture into 200 ml TS medium (10 ng/ml). Make 20 aliquots (10 ml) and store at -20°C until use. Add one aliquot per 100 mm plate.

Mouse embryonic fibroblast-condition medium (MEF-CM):
Plate MEFs in 100 mm plates (1 x 10⁶/plate). Next day, add 10 ml TS medium per dish and continue to culture for 48 hours. Collect the culture medium, filter them (0.45 mm) and store at -20°C in 35 ml aliquots. Thaw each aliquot when needed which can be stored at 4°C. The MEFs can be used to prepare for two more batches of CM before they become confluent.

PBS/BSA:
Dissolve BSA, fraction V (Sigma A3311, 0.1% (w/v)) in PBS (10 ml), filter through a 0.45 mm syringe filter and make 1 ml aliquots in 1.5 ml tubes. Store at -70°C and thaw one tube when needed to prepare FGF4.

FGF4 (1000x):
Resuspend lyophilized FGF4 (Sigma F8424, 25 mg) with 1 ml of the PBS/BSA solution. Mix well and make 10 aliquots (100 ml) into 1.5 ml tubes and store at -70°C. Thaw each tube when needed and store the remaining at 4°C, do not re-freeze. Dilute 1000 times in TS medium to obtain 1x FGF4 (25 ng/ml).

Heparin (1000x):
Resuspend heparin (Sigma H3149, 10,000 units) in PBS to a final concentration of 1 mg/ml (1000x). Make 100 ml aliquots into 1.5 ml tubes and store at -70°C. Thaw aliquots when needed and store the remaining at 4°C, do not re-freeze. Dilute 1000 time in TS medium to obtain 1x heparin (1 ng/ml).