Cette vidéo montre des expériences avec l'analyse subséquente des interactions protéine-protéine par l'utilisation de micro-surfaces texturées. L'approche offre la possibilité de détecter les interactions entre protéines dans les cellules vivantes et combine haute capacité de débit avec la possibilité d'extraire des informations quantitatives.
Démêler le réseau d'interaction des molécules<em> In vivo</em> Est la clé de la compréhension des mécanismes qui régulent la fonction cellulaire et du métabolisme. Une multitude d'options méthodologiques pour aborder les interactions moléculaires dans les cellules ont été développés, mais la plupart de ces méthodes souffrent d'être plutôt indirect et par conséquent guère quantitatives. Au contraire, quelques-uns de haut de gamme des approches quantitatives ont été introduites, qui sont toutefois difficile à étendre à haut débit. Pour combiner des capacités haut débit avec la possibilité d'extraire des informations quantitatives, nous avons récemment développé un nouveau concept d'identification des interactions protéine-protéine (Schwarzenbacher<em> Et al</em>., 2008). Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour la conception et la construction de ce système qui permet d'analyser les interactions entre un fluorophore protéine marquée («proie») et une protéine de membrane («appât»)<em> In vivo</em>. Les cellules sont étalées sur des surfaces fonctionnalisées micropatterned avec des anticorps contre le domaine des appâts exoplasmic. Appât-proie interactions sont analysés à travers la redistribution de la proie fluorescentes. La méthode est caractérisée par une sensibilité élevée jusqu'au niveau de molécules uniques, la capacité de détecter des interactions faibles, et la capacité de débit élevé, rendant applicable comme outil de dépistage.
La vidéo qui l'accompagne montre une méthode pour détecter les interactions protéine-protéine dans le plasma de la membrane des cellules vivantes (Schwarzenbacher et al, 2008;. Brameshuber et al, 2009;.. Weghuber et al, sous presse). En principe, n'importe quelle plateforme de microscopie TIRF basé peut être utilisé comme système de lecture. Ce n'est que lorsque la sensibilité élevée est souhaitée (par exemple pour la détection de molécules uniques), les microscopes de pointe seront nécessaires. Pour obtenir les meilleurs résultats les points critiques suivants pendant le processus de préparation nécessitent une attention particulière:
La technique de micro-motifs propose plusieurs possibilités pour l'analyse des interactions protéine-protéine. Tout d'abord, avec la quantification des locaux, résolues spatialement interactions protéine-protéine a également la détection des interactions faibles ou indirecte n'est possible sans l'inconvénient de donner un nombre élevé de faux positifs ou négatifs. Deuxièmement, elle permet au chercheur d'analyser les interactions entre protéines dans le plasma de la membrane des cellules vivantes, ce qui est difficile à réaliser par des approches biochimiques comme l'écran 2-hybride. Troisièmement, l'approche permet la détection de l'appât-proie interactions qui sont modulés par les changements environnementaux comme la température, la présence de différentes protéines ou autres molécules ou modifications post-traductionnelles. Ainsi, le test de dépistage permet de modulateurs de l'interaction d'une paire donnée dans le contexte de cellules vivantes. Par ailleurs, en réduisant la densité de surface du ligand de capture ou de l'utilisation de ligands monovalents, l'analyse de l'état de repos devient possible. Enfin, si les plates-formes adéquates de numérisation sont utilisés, le nombre de cellules analysées est suffisamment élevé pour correspondre à la demande haut débit des entreprises pharmaceutiques pour le dépistage de drogue (Ramm, 2005).
The authors have nothing to disclose.
Nous tenons à remercier Quentina Beatty, Université de Linz, en Autriche, pour son aide genre, Katharina Strub, Université de Genève, en Suisse, pour la construction d'hCD71-GFP, et Daniel Legler, Université de Constance, en Suisse, pour le GPI-GFP -DAF construire. Ce travail a été soutenu par le Fonds autrichien pour la science (FWF; projet Y250-B03) et le projet GEN-AU du Ministère fédéral autrichien pour la science et la recherche.