Denna video visar experiment med efterföljande analys av protein-protein interaktioner med hjälp av mikro-mönstrade ytor. Den metod som ger möjlighet att upptäcka protein interaktioner i levande celler och kombinerar hög genomströmning kapacitet med möjlighet att utvinna kvantitativ information.
Reda ut interaktionen nätverk av molekyler<em> In vivo</em> Är nyckeln till att förstå de mekanismer som reglerar cellernas funktion och ämnesomsättning. En mängd metodologiska möjligheter att behandla molekylära interaktioner i celler har utvecklats, men de flesta av dessa metoder lider av att vara tämligen indirekta och därför knappast kvantitativa. Tvärtom, några high-end kvantitativa metoder infördes, som dock är svåra att omfatta hög genomströmning. Att kombinera hög genomströmning kapacitet med möjlighet att utvinna kvantitativ information, utvecklade vi nyligen ett nytt koncept för att identifiera protein-protein interaktioner (Schwarzenbacher<em> Et al</em>., 2008). Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för utformningen och konstruktionen av detta system som gör det möjligt att analysera samspelet mellan ett fluoroforen märkt protein ("offer") och ett membran protein ("bete")<em> In vivo</em>. Celler är pläterade på micropatterned ytor functionalized med antikroppar mot betet exoplasmic domän. Bait-byte interaktioner analyseras via en omfördelning av de fluorescerande byte. Metoden kännetecknas av hög känslighet ned till nivån av enstaka molekyler, förmågan att upptäcka svag växelverkan, och hög kapacitet kapacitet, vilket gör den tillämplig verktyg för screening.
Den medföljande videon demonstrerar en metod för att upptäcka protein-protein interaktioner i plasma-membranet av levande celler (Schwarzenbacher et al, 2008;. Brameshuber et al, 2009;.. Weghuber et al, in press). I princip kan alla TIRF-baserad mikroskopi plattform användas som avläsning system. Först när hög känslighet önskas (exempelvis för detektion av enstaka molekyler) kommer avancerade mikroskop krävas. För att uppnå bästa resultat följande kritiska punkter under förberedelseprocessen kräver särskild uppmärksamhet:
Mikro-mönstring tekniken erbjuder flera möjligheter för analys av protein-protein interaktioner. För det första, tillsammans med kvantifiering av lokala, rumsligt upplösta protein-protein interaktioner också att upptäcka svag eller indirekt interaktion är möjlig utan nackdelen att ge ett stort antal falska positiva eller negativ. För det andra gör det möjligt för forskare att analysera protein-protein interaktioner i plasma-membranet av levande celler, som är svår att uppnå genom biokemiska metoder som 2-hybrid skärmen. För det tredje tillvägagångssättet möjliggör detektion av bete-byte interaktioner som moduleras av miljöförändringar såsom temperatur, förekomst av olika proteiner eller andra molekyler eller post-translationella modifieringar. Alltså analysen möjliggör screening modulatorer av en viss interaktion par i samband med levande celler. Dessutom, genom att minska ytan densitet fånga ligand eller användning av monovalent ligander, blir analysen av vilotillstånd möjligt. Slutligen, om tillräckliga skanning plattformar används, är antalet analyserade celler tillräckligt hög för att matcha hög genomströmning krav på läkemedelsföretag för narkotika screening (Ramm, 2005).
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Quentina Beatty, universitetet i Linz, Österrike, för hennes vänliga hjälp, Katharina Strub, Universitetet i Genève, Schweiz, för hCD71-GFP konstruera, och Daniel Legler, University of Konstanz, Schweiz, för GPI-GFP -DAF konstruktion. Detta arbete stöddes av den österrikiska Science Fund (FWF, projekt Y250-B03) och GEN-AU projekt av Österrikes federala ministerium för vetenskap och forskning.