और Zebrafish Hindbrain में लेबल इमेजिंग कक्ष
Summary
Morphogenetic प्रक्रियाओं है कि जल्दी भ्रूण आकार को समझने के लिए कुंजी उच्च संकल्प छवि कोशिकाओं करने की क्षमता है. हम यहाँ पूरे zebrafish भ्रूण में झिल्ली लक्षित हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ एकल कक्षों या कक्षों छोटे समूहों लेबलिंग के लिए एक तकनीक का वर्णन.
Abstract
Morphogenetic प्रक्रियाओं है कि जल्दी हड्डीवाला भ्रूण के आकार को समझने के लिए कुंजी उच्च संकल्प छवि कोशिकाओं करने की क्षमता है. Zebrafish भ्रूण, मोज़ेक अभिव्यक्ति में प्लास्मिड डीएनए परिणामों के इंजेक्शन, एकल कक्षों या कक्षों के छोटे समूहों के दृश्य के लिए अनुमति<sup> 1</sup>. हम वर्णन कैसे एक सर्वव्यापी प्रमोटर के नियंत्रण के तहत प्लास्मिड डीएनए झिल्ली लक्षित हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (mGFP) एन्कोडिंग का इंजेक्शन इमेजिंग neurulation के दौर से गुजर कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल के लिए केन्द्रीय वर्गों में भी और वास्तविक समय में उच्च संकल्प इमेजिंग लेबल कोशिकाओं के लिए पद्धति है. इस प्रोटोकॉल युवा zebrafish भ्रूण में mGFP डीएनए के इंजेक्शन की जरूरत पर जोर देता है. भ्रूण तो vibratome सेक्शनिंग, एंटीबॉडी लेबलिंग और एक confocal खुर्दबीन के साथ इमेजिंग के लिए संसाधित कर रहे हैं. वैकल्पिक रूप से, जीना mGFP व्यक्त भ्रूण समय चूक confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग imaged किया जा सकता है. हम पहले इस सरल दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया है करने के लिए सेलुलर व्यवहार है कि zebrafish भ्रूण के hindbrain क्षेत्र में न्यूरल ट्यूब गठन ड्राइव का विश्लेषण<sup2></sup>. तय तैयारी सेल आकार और न्यूरल ट्यूब में संगठन की अभूतपूर्व दृश्य के लिए अनुमति दी है जबकि रहते इमेजिंग इस दृष्टिकोण सेलुलर गतिशीलता है कि neurulation के दौरान जगह लेने के एक बेहतर समझ को सक्षम करने पूरित.
Protocol
Discussion
अंत में, लेबलिंग तकनीक यहाँ वर्णित zebrafish भ्रूण में morphogenetic प्रक्रियाओं की एकल कोशिका विश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं. इस प्रोटोकॉल के प्राथमिक एक सर्वव्यापी प्रमोटर के नियंत्रण के अधीन तंत्रिका mGFP का उपयो?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम एक NIH आर Brewster (1R01GM085290 01A1) को सम्मानित किया अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
Solutions
- Hank’s Stock #1: 8.0 g NaCl , 0.4 g KCl in 100 ml dd H2O
- Hank’s Stock #2: 0.358 g Na2HPO4 Anhydrous, 0.60 g KH2PO4 in 100 ml ddH2O
- Hank’s Stock #4: 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O
- Hank’s Stock #5: 1.23 g MgSO4x7H2O in 50 ml dd H2O
- 1 X Phosphate Buffer: 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.02 M PO4, pH 7.3
- Blocking Solution: 2% normal goat serum, 1% bovine serum albumin (BSA), 1% dimethysulfoxide (DMSO)
Riferimenti
- Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish Practical approach series. , (2002).
- Hong, E., Brewster, R. N-cadherin is required for the polarized cell behaviors that drive neurulation in the zebrafish. Development. 133, 3895-3905 (2006).
- Andersen, E., Asuri, N., Clay, M., Halloran, M. Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos. J Vis Exp. , (2010).
