Zell Elektroschweißmuffe Visualisierte mit Fluoreszenz-Mikroskopie

Summary

In diesem Video zeigen wir effiziente Elektrofusion von Zellen<em> In-vitro-</em> Durch modifizierte Einhaltung Methode mittels Elektroporation und der anschließenden Detektion der fusionierten Zellen Visualisierung mit Fluoreszenzmikroskopie.

Abstract

Zell Elektrofusion ist eine sichere, nicht-virale und nicht-chemischen Methode, die für die Vorbereitung Hybridzellen für die menschliche Therapie eingesetzt werden können. Elektrofusion umfasst die Anwendung von kurzen Hochspannungs-elektrische Impulse auf Zellen, die in engem Kontakt sind. Anwendung von kurz-, Hochspannungs-elektrische Impulse bewirkt eine Destabilisierung der Zell-Plasmamembranen. Destabilisierte Membranen sind durchlässig für verschiedene Moleküle und auch anfällig für Fusion mit einer benachbarten destabilisiert Membranen. Elektrofusion ist somit eine bequeme Methode, um eine unspezifische Verschmelzung von sehr verschiedenen Zellen zu erreichen<em> In-vitro-</em>. Um fusion, Zellmembranen, durch elektrisches Feld destabilisiert zu erhalten, muss in einem engen Kontakt sein, damit Zusammenlegung ihrer Lipid-Doppelschichten und damit ihrem Zytoplasma. In diesem Video zeigen wir, effiziente Elektrofusion von Zellen<em> In-vitro-</em> Durch modifizierte Einhaltung Methode. Bei dieser Methode, Zellen dürfen nur leicht anzubringen, um die Oberfläche des gut, so dass mittelfristig ausgetauscht werden können und Zellen noch behalten ihre Kugelform. Fusion Visualisierung wird durch pre-Kennzeichnung von dem Zytoplasma von Zellen mit unterschiedlichen fluoreszierenden Zellen tracker Farbstoffe untersucht, die Hälfte der Zellen sind mit orangen CMRA und die andere Hälfte mit grünen CMFDA gekennzeichnet. Fusion Ausbeute ist definiert als die Anzahl der dual fluoreszierenden Zellen mit der Anzahl aller Zellen durch zwei dividiert bestimmt.

Protocol

I. Das Laden der Zellen mit Cell-Tracker CMFDA und CMRA Die Experimente wurden auf vorher vorbereiteten Zellen der Maus-Melanom-Zelllinie (B16-F1) durchgeführt. Die Zellen werden in zwei getrennten 25 cm 2 Kulturflaschen (TPP, ZDA) auf 70-80% Konfluenz in DMEM Kulturmedium (Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium) mit 10% fötalem Rinderserum, 0,15 mg / ml L-Glutamin, 16 mg ergänzt gewachsen / ml Gentamycin (alle von Sigma-Aldrich, Deutschland), 200 Einheiten / ml crystacillin (Pliva, Kroatien) und inkubiert in 5% CO 2 bei 37 ° C. Bereiten Sie zwei 10 mM Stammlösungen von Cell-Tracker (Invitrogen, USA) durch Zugabe von 10,76 ul und 9 ul (für Grüne CMFDA und für Orange CMRA jeweils) DMSO (Sigma-Aldrich, Deutschland) bis 50 ug des Farbstoffes in der ursprünglichen Invitrogen Durchstechflasche. Die Stammlösung kann in einem Kühlschrank bei 4 ° C für wenige Monate gelagert werden. Vor Beginn der Experimente, warm up der Lösung, bis sich die Kristalle von DMSO auflösen. Bereiten Bicarbonat-freien Krebs-Hepes-Puffer (130 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgSO 4, 1,2 mM KH 2 PO 4, 11,7 mM D-Glucose, 1,3 mM CaCl 2, 10 mM HEPES, pH 7,4). In zwei 15 ml Eppendorf-Röhrchen getrennt Mix 2,1 ul jeder Stammlösung (10 mM CMFDA oder CMRA jeweils) in 3 ml Bicarbonat-freien Krebs-Hepes-Puffer. Dies ergibt eine "loading solution" mit etwa 7 uM CMFDA (oder CMRA). Spülen Sie die Zellen zweimal mit Bicarbonat-freien Krebs-Hepes-Puffer und fügen Sie dann loading Lösungen in den Kolben. Inkubieren Zellen für 30 Minuten in 5% CO 2 bei 37 ° C. Während dieser ersten Inkubation Reagenzien frei durch Zellmembranen, aber einmal im Inneren der Zelle werden die Reagenzien in Zell-impermeante fluoreszierende Reaktionsprodukte umgewandelt. Nach der ersten Inkubation, spülen und inkubieren Zellen mit Kulturmedium für weitere zwei Stunden in 5% CO 2 bei 37 ° C. Trypsinize Zellen in beiden Flaschen (beladen mit CMFDA und CMRA) und mischen rote und grüne Zellen in einem Verhältnis 1:1 in einem 50 ml Zentrifugenröhrchen (TPP, ZDA). Passen Zellkonzentration auf 5 x 10 6 Zellen / ml durch Verdünnung mit DMEM-Medium oder durch Konzentration mit Zentrifuge. Legen Sie eine 20 pl Tropfen Zellsuspension in jede Vertiefung von 24 Multiwellplatte (TPP, ZDA). Inkubieren Zellen in 5% CO 2 bei 37 ° C für 20 min, damit sie leicht auf der Oberfläche des gut befestigen und zu etablieren Zell-Kontakten. II. Elektrofusion Bereiten isoosomolar Kaliumphosphatpuffer (10 mM KH2PO4, 10 mM K 2 HPO 4, 1 mM MgCl 2, 250 mM Saccharose) und hypoosmolar Kaliumphosphatpuffer (10 mM KH2PO4, 10 mM K 2 HPO 4, 1 mM MgCl 2, 75 mM Saccharose) . Legen Sie die Multiwell mit Zellen auf dem Mikroskoptisch, Position der Elektroden an der Unterseite des Brunnens und verbinden sie mit dem Impulsgenerator. Waschen Sie die Zellen mit 1 ml isoosomolar Kaliumphosphatpuffer. Add 350 ul hypoosmolar Kaliumphosphatpuffer um Zellschwellung zu induzieren. Der Puffer sollte sich auf den Elektroden. Lassen Sie Zellen in hypoosmolar Puffer für 2 Minuten vor dem Anlegen von elektrischen Impulsen. Während dieser Zeit Zustrom von Wasser-Moleküle in die Zellen durch osmotischen Ungleichgewicht zwischen dem Inneren und dem Äußeren der Zellen zu einem Anstieg des Zellvolumens. Elektrische Impulse sollten angewendet werden, wenn Zellen in der Nähe ihrer maximalen Volumina werden, bevor regulatorischen Volumenabnahme starten. Um eine optimale Elektrofusion erreichen und aufrechtzuerhalten Lebensfähigkeit der Zellen, sollten die optimalen Parameter der elektrischen Impulse genutzt werden. Diese auf Zelllinie verwendet [1] ab. In diesem Experiment ein Zug von 8 Rechteckimpulse (jeweils mit einer Dauer von 100 us bei 1 Hz) ist zu jeder Probe aufgebracht, mittels Elektroporation Gerät (in unserem Fall Cliniporator, IGEA, Italien). Die Impulse werden auf zwei parallel Pt / Ir-Draht-Elektroden mit 0,8 mm Durchmesser und 5 mm Abstand zwischen ihnen ausgeliefert, der ein elektrisches Feld von etwa 1200 V / cm zwischen den Elektroden in jedem gut, außer für die Steuerung gut. Lassen Sie die Zellen ungestört 10 Minuten nach dem Puls-Lieferung. Bestimmen Sie die Fusionsausbeute mittels Fluoreszenz-und Phasenkontrast-Mikroskopie. III. Bildaufnahme und die Bestimmung des Fusionsausbeute Die Zellen werden beobachtet mit einem Fluoreszenzmikroskop (in unserem Fall Zeiss Axiovert 200, Zeiss, Deutschland) mit einem Objektiv (x20) und eine gekühlte CCD-Kamera (VisiCam 1280, Visitron, Deutschland) ausgestattet. Die Bilder werden in MetaMorph 7.1.1 (Molecular Devices, USA) erworben, aber auch andere ähnliche Software zur Erfassung kann ebenfalls verwendet werden. CMFDA ist mit einem Monochromator (Polychrome IV, Visitron, Deutschland) bei 492 nm und CMRA bei 548 nm angeregt. Die Fluoreszenz der CMFDA und CMRA erworben wird mit zwei Emissionsfilter, einer bei 535 nm zentriert (HQ535/30m für CMFDA) und die andere zentriert bei 510 nm (D605/55m, für CMRA, sowohl Chroma, USA). Die Verwendung von dichroitischen Spiegel (Q515LP) verhindert den Kanal Übersprechen. Erwerben Sie drei Bilder (Phasenkontrast, rote und grüne Fluoreszenz) für fünf zufällig ausgewählte Felder in jedem gut. Erstellen Sie drei Kanal-Bilder aus jedem Bild Triplett. In einem solchen Bild fluoreszierenden Zytoplasma kann zusammen mit den Zellmembranen gesehen werden. Fusionierten Zellen können somit einfach bestimmt werden [Abb. 1]. Zählen Sie alle drei Arten von Zellen (rot, grün und dual fluoreszierend) in jeweils drei Kanal-Bild. Bestimmen Sie den Prozentsatz der dual fluoreszierenden Zellen, indem die Zahl der dual fluoreszierenden Zellen mit der Anzahl aller Zellen in jedem Bild. Fusion Ausbeute ist definiert als der Anteil der dual fluoreszierenden Zellen mit 2 multipliziert definiert, da die Hälfte der fusionierten Zellen nicht erkannt werden (wenn die Zellen in der gleichen Farbe Sicherung). Repräsentative Ergebnisse Abbildung 1 Drei-Kanal-Aufnahme von B16F1 Zellen nach Elektrofusion:. Phasenkontrast, CMRA Fluoreszenz (Anregung bei 548 nm) und CMFDA Fluoreszenz (Anregung bei 492 nm), Objektiv-Vergrößerung 20x

Discussion

Die Fähigkeit der Zellmembranen zu unspezifisch, zB durch äußere elektrische Felder, Sicherung ist für die Biotechnologie, Medizin und Forschung in der Biologie wichtig. Solche unspezifischen Fusion ermöglicht die Produktion von hochwertigen Hybrid-Zellen und ihre Produkte, wie monoklonale Antikörper, und liefert Informationen über grundlegende Mechanismen der Fusion [2]. Elektrofusion ist eine potenziell sehr wirksame Methode, da kann es richtig, um verschiedene Arten von Zellen eingestellt werden. Elektrofusion wird erreicht, wenn Zellen in engen körperlichen Kontakt in ihre fusogene Zustand gebracht werden (Gefahr der Fusion) mit Hilfe von Hochspannungs-elektrischen Impulsen. Die Effizienz der Elektrofusion hängt von verschiedenen Parametern, die beiden Teile der Elektrofusion Prozess beeinflussen. Erster Teil des Heizwendel-ist das Erreichen des engen körperlichen Kontakt zwischen den Zellen, die mit verschiedenen Methoden erhalten werden [3-8]. Die Einhaltung Methode (wachsenden Zellen bis zur Konfluenz) können effizient durch spontan entstandene Zellkontakte in großen Zonen zwischen Zellen verwendet werden, jedoch bringt es sehr große fusionierten Zellen mit vielen Kernen. Wir sind mit der modifizierten Einhaltung Methode, wo kleinere Zellen (mit 2 bis 5 Kerne), die eher zu überleben und sich vermehren, gewonnen werden (Abbildung 1). Kontakt zwischen den Zellen auch aus osmotischen Schwellung der Zellen profitieren durch osmotische Behandlung im Experiment [9] verwendet. Zweiter Teil der Elektrofusion Prozess ist das Erreichen der fusogene Zustand der Zellmembranen. Fusogene Zustand korreliert gut mit electropermeabilized Zustand der Membran (Zellen sind unspezifisch permeabilisiert, um Moleküle, die normalerweise nicht durch die intakte Membran passieren können) und wird von den gleichen Parametern der elektrischen Impulse (Amplitude, Länge, Anzahl und Häufigkeit) geregelt [10] . Die Werte der elektrischen Parameter für die optimale Elektroporation benötigt [1] und Elektrofusion zwischen verschiedenen Zellen unterschiedlich und hängen von Zellen Größe und ihrer biologischen Eigenschaften. Elektrische Parameter müssen daher für verschiedene Zelllinien, die als Fusionspartner verwendet werden, die Fusion zu erhalten optimiert werden.

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
CMRA	Reagent	Invitrogen	C34551	Cytosolic fluorescent dye
CMFDA	Reagent	Invitrogen	C7025	Cytosolic fluorescent dye
DMSO	Reagent	Sigma-Aldrich	D2650
DMEM	Reagent	Sigma-Aldrich	D5671	Dulbecco’s modified Eagle’s medium
Fetal calf serum	Reagent	Sigma-Aldrich	F4135
L-glutamine	Reagent	Sigma-Aldrich	G7513
crystacillin	Reagent	Pliva	625110	antibiotic
gentamicin	Reagent	Sigma-Aldrich	G1397	antibiotic
Hepes	Reagent	Sigma-Aldrich	H0887
KH2PO4	Reagent	Merck	A124873 927
KH2PO4	Reagent	Sigma-Aldrich	4248
MgCl2	Reagent	Sigma-Aldrich	M-8266
NaCl	Reagent	Fluka	71382
KCl	Reagent	Merck	A154336 908
MgSO4	Reagent	Sigma-Aldrich	M2643
D-glucose	Reagent	Sigma-Aldrich	G8270
CaCl2	Reagent	Sigma-Aldrich	C4901
sucrose	Reagent	Sigma-Aldrich	16104
Electric pulse generator	Tool	Igea		Cliniporator VITAE
Multiwell plate	Tool	TPP	92424
50 ml centrifuge tube	Tool	TPP	91050
15 ml centrifuge tube	Tool	TPP	91015
25 cm2 culture flask	Tool	TPP	90026
Electrodes	Tool	Custom made		Pt/Ir