El análisis de ADN de doble cadena Break (OSD) de reparación en células de mamífero
Summary
En este artículo se describen las buenas prácticas agrarias basadas en la fluorescencia<em> In vivo</em> Pruebas que cuantificar por separado la recombinación homóloga y no homóloga fin de unirse en células de mamíferos.
Abstract
ADN de doble filamento se rompe son las lesiones del ADN más peligrosa que puede conducir a la pérdida masiva de información genética y la muerte celular. Las células de reparación de DSBs con dos vías principales: no homólogos fin de unirse (NHEJ) y recombinación homóloga (HR). Las perturbaciones de NHEJ y de recursos humanos a menudo se asocian con el envejecimiento prematuro y la tumorogénesis, por lo tanto es importante tener una forma cuantitativa de medición de cada vía de reparación del OSD. Nuestro laboratorio ha desarrollado estructuras fluorescentes reportero que permiten la medición sensible y cuantitativo de NHEJ y de recursos humanos. Las construcciones se basan en un gen GFP diseñado que contiene sitios de reconocimiento para un poco de corte I-II CPE endonucleasa para la inducción de DSBs. Las construcciones de partida son las buenas prácticas agrarias negativas como el gen de la GFP se inactiva por un exón adicional, o por mutaciones. Éxito de la reparación de la I-SCE-inducida por NHEJ rompe o HR restaura el gen GFP funcional. El número de células GFP positivos contados por citometría de flujo proporciona una medida cuantitativa de NHEJ o la eficiencia de recursos humanos.
Protocol
Discussion
Los fluorescentes NHEJ y ensayos HR reportero proporcionan una forma cuantitativa para medir por separado cada vía de reparación del OSD en vivo. Los ensayos son muy sensibles, como FACS puede detectar con fiabilidad 10 células GFP + de 20.000 células. Los ensayos pueden ser adaptados para medir los eventos de reparación en "tiempo real" mediante la detección de la aparición de células GFP + en minutos u horas después de la inducción de DSBs 2. Además, el análisis de las célula…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El original GFP-Pem1 fue un regalo del doctor Li Lei. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del NIH y la Ellison Medical Foundation de VG y AS
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| EndoFree Plasmid Maxi kit | Qiagen | 12362 | ||
| Qiaex II Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | ||
| Amaxa Nucleofector | Lonza | AAD-1001 | ||
| Geneticin (G418) | Invitrogen | 11811-031 | ||
| pDsRed2-N1 | Clontech | 632406 | ||
| Round bottom tubes | BD Falcon | 352058 | FACS tubes |
Riferimenti
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- Mao, Z., Bozzella, M., Seluanov, A., Gorbunova, V. Comparison of nonhomologous end joining and homologous recombination in human cells. DNA Repair (Amst). 7, 1765-1771 (2008).
- Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. Expression of a site-specific endonuclease stimulates homologous recombination in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 91, 6064-6068 (1994).
- Mao, Z., Jiang, Y., Xiang, L., Seluanov, A., Gorbunova, V. DNA repair by homologous recombination, but not by nonhomologous end joining, is elevated in breast cancer cells. Neoplasia. 11, 683-691 (2009).
- Seluanov, A., Mittelman, D., Pereira-Smith, O. M., Wilson, J. H., Gorbunova, V. DNA end joining becomes less efficient and more error-prone during cellular senescence. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 7624-7629 (2004).
- Mao, Z., Bozzella, M., Seluanov, A., Gorbunova, V. DNA repair by nonhomologous end joining and homologous recombination during cell cycle in human cells. Cell Cycle. 7, 2902-296 (2008).
