Summary
Detta protokoll beskriver användningen av en specialdesignad inspelningsenhet och elektroder för att registrera lokala fältpotentialer och undersöka informationsflödet i musens hippocampus och prefrontala cortex.
Abstract
Tekniken för att registrera lokala fältpotentialer (LFP) är en elektrofysiologisk metod som används för att mäta den elektriska aktiviteten hos lokaliserade neuronala populationer. Det fungerar som ett viktigt verktyg inom kognitiv forskning, särskilt i hjärnregioner som hippocampus och prefrontala cortex. Dubbla LFP-inspelningar mellan dessa områden är av särskilt intresse eftersom de gör det möjligt att utforska interregional signalkommunikation. Metoderna för att utföra dessa inspelningar beskrivs dock sällan, och de flesta kommersiella inspelningsenheter är antingen dyra eller saknar anpassningsförmåga för att tillgodose specifika experimentella konstruktioner. Denna studie presenterar ett omfattande protokoll för att utföra LFP-inspelningar med dubbla elektroder i musens hippocampus och prefrontala cortex för att undersöka effekterna av antipsykotiska läkemedel och kaliumkanalmodulatorer på LFP-egenskaper i dessa områden. Tekniken gör det möjligt att mäta LFP-egenskaper, inklusive kraftspektra inom varje hjärnregion och koherens mellan de två. Dessutom har en billig, specialdesignad inspelningsenhet utvecklats för dessa experiment. Sammanfattningsvis ger detta protokoll ett sätt att spela in signaler med höga signal-brusförhållanden i olika hjärnregioner, vilket underlättar undersökningen av interregional informationskommunikation i hjärnan.
Introduction
Lokala fältpotentialer (LFP) hänvisar till den elektriska aktiviteten som registreras från det extracellulära utrymmet, vilket återspeglar den kollektiva aktiviteten hos en lokaliserad grupp av neuroner. De uppvisar ett brett spektrum av frekvenser, som sträcker sig från långsamma vågor vid 1 Hz till snabba svängningar vid 100 Hz eller 200 Hz. Specifika frekvensband har associerats med kognitiva funktioner som inlärning, minne och beslutsfattande 1,2. Förändringar i LFP-egenskaper har använts som biomarkörer för olika neurologiska sjukdomar, inklusive demens och schizofreni 3,4. Att analysera LFP-inspelningar kan ge värdefulla insikter om de underliggande patologiska mekanismerna som är förknippade med dessa tillstånd och potentiella terapeutiska strategier.
Dubbel LFP-inspelning är en teknik som används för att mäta lokaliserad elektrisk aktivitet inom och mellan två specifika hjärnregioner. Denna teknik ger en värdefull möjlighet att undersöka den intrikata neurala dynamiken och signalkommunikationen som sker inom och mellan distinkta hjärnregioner. Tidigare studier har visat att det kan vara komplicerat att upptäcka förändringar i de neuronala egenskaperna hos enskilda hjärnregioner, men förändringar i interregional kortikal kommunikation kan observeras 5,6. Därför erbjuder användningen av dubbel LFP-inspelning ett kraftfullt sätt att ta itu med detta problem.
Hippocampus-prefrontal konnektivitet spelar en avgörande roll för att modulera kognitiva funktioner, och dysfunktion har kopplats till olika neurologiska störningar 7,8. Dubbla elektrodinspelningar av dessa regioner kan ge information om dessa interaktioner. Tyvärr finns det begränsad information tillgänglig om metoder för att utföra LFP-inspelningar med dubbla elektroder mellan dessa områden. Dessutom är kommersiellt tillgängliga inspelningsutrustning i allmänhet dyr och saknar anpassningsförmåga till specifika experimentella utformningar. Den konventionella metoden för att registrera LFP:er innebär att man använder en skärmad kabel för att ansluta inspelningsenheten till elektroder som implanteras i ett djurs hjärna. Detta tillvägagångssätt är dock känsligt för rörelseartefakter och omgivningsbrus, vilket påverkar kvaliteten och tillförlitligheten hos de inspelade signalerna.
Detta protokoll beskriver en omfattande procedur för att utföra LFP-inspelningar med dubbla elektroder i musens hippocampus och prefrontala cortex, med hjälp av ett billigt specialdesignat huvudstadium som kan placeras på djurets huvud. Dessa metoder gör det möjligt för forskare att undersöka regionspecifika oscillerande mönster inom två diskreta cerebrala regioner och utforska interregionalt informationsutbyte och konnektivitet mellan dessa områden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna studie godkändes av Florey Animal Ethics Committee (University of Melbourne, No. 22-025UM) i enlighet med den australiensiska koden för vård och användning av djur för vetenskapliga ändamål. C57BL/6 hanmöss (8 veckor), erhållna från Animal Resources Centre (Australien), användes för den aktuella studien.
1. Utformning och tillverkning av huvudscenen
OBS: Huvudscenen PCB-kort är en kompakt 14 mm x 12 mm fyrskiktsskiva designad för att placeras direkt på djurets huvud. Den använder ett kommersiellt förstärkarchip (se Materialförteckning), och alla design- och Gerber-filer finns tillgängliga online (GitHub-länk: https://github.com/dechuansun/Intan-headstage/tree/main/pcbway).
- Ange följande specifikationer till tillverkaren: Brädans tjocklek: 0,6 mm; Minsta spårning/avstånd: 4 mils; Minsta hålstorlek: 0,2 mm.
- Under PCB-monteringsprocessen, följ denna ordning:
- Löd amplifier chipet på kortet med en varmluftspistol inställd på 350 °C.
- Löd de passiva komponenterna.
- Löd SPI-kontakten och elektrodkontakten (se materialtabell).
- Inspektera lödningen under ett mikroskop för kvalitetssäkring. Fäst SPI-kontakten på plats med epoxi för ökad stabilitet.
- Använd inspelningsprogramvara från tredje part och ett styrkort (se Materialförteckning) för signalinsamling. Se programvarans användarhandbok för detaljerade instruktioner.
- Det designade headstage stöder 8 kanaler. Aktivera kanalerna 8, 9, 12, 13, 20, 21, 22 och 23 för inspelning i programvaran.
2. Tillverkning av elektroder
- Klipp PFA-belagda volframtrådar (se materialförteckning) till specifika längder för olika elektrodtyper: prefrontal cortexelektrod (12 mm), hippocampuselektrod (10 mm) och jordelektrod (6 mm).
- Skär mässingsröret (se materialtabell) i 3 mm segment.
- Ta bort 2 mm av beläggningen i änden av varje tråd med en tändare och löd sedan fast elektrodtråden ordentligt på mässingsröret. Mässingsröret har en innerdiameter på 0,45 mm och en ytterdiameter på 0,60 mm.
- För jordelektroden, löd en M1.2 rostfri skruv (se materialtabell) till elektroden. Applicera fosforsyrabaserat flussmedel på skruven för att förbättra lödningen. Efter lödning, rengör skruven med alkohol.
OBS: Använd handskar för skydd under lödningsprocessen.
3. Kirurgiskt ingrepp
- Bedöva musen i en anestesikammare med 3% isofluran och 1 L/min syreflöde.
- Placera den sövda musen på en värmedyna och fäst den i en stereotaktisk ram (se Materialtabell).
- Justera underhållshastigheten av isofluran till 2,5-3 % och minska syrgasflödet till 500 ml/min. Använd tånypet för att kontrollera om djuret fortfarande är under djup anestesi.
- Injicera karprofen subkutant 0,5 mg/kg och applicera ögonsalva för ögonskydd.
- Raka och sterilisera musens huvud med povidon-jod och 80 % etanol.
- Gör ett 8 mm snitt längs mitten av hårbotten och ta bort bindväv i snittområdet.
- Applicera väteperoxid för att rengöra skallens yta, var försiktig så att du inte rör vid den omgivande huden.
- Rikta in landmärkena bregma och lambda på samma nivå för exakt elektrodplacering (bregma och lambda är där den sagittala suturen skär koronal- och lambdoidsuturerna).
- Borra hål för referens-/jordelektrod, ankarskruvar (0,9 mm borrgrad) och aktiva elektroder (0,3 mm borrborr) vid angivna koordinater.
- Fäst den specialtillverkade elektroden (steg 2) på den stereotaktiska ramarmen och se till att den är vinkelrät mot hjärnan.
- Implantera elektroden i hippocampus CA1-området (AP - 1,8 mm, ML - 1,3 mm, DV - 1,4 mm).
OBS: AP, anteroposterior; ML, mediolateral; DV, dorsoventral. - Upprepa elektrodimplantationen i prefrontala cortex (AP - 2,0 mm, ML - 0,3 mm, DV - 1,7 mm).
- Säkra elektroderna med ett kommersiellt tillgängligt kraftfullt lim och dentalcement (se materialtabell).
- Implantera två 1,2 mm förankringsskruvar (AP - 1,8 mm, ML -1,6 mm) för att förhindra rörelse.
- Placera referens-/jordelektroden i direkt kontakt med dura mater, 2 mm bakom och 2 mm ensidigt om lambda-landmärket.
- Anslut mässingsrörssidan av elektroderna till en flerkanalig kontakt (se Materialtabell) med jordelektroden i mitten.
- Använd 0,8 mm krympslang på utsidan av mittstiftet för isolering.
- Fäst elektroderna, ankarskruvarna och kontakten med lim och tandcement.
4. Postoperativ vård
- För att lindra postoperativ smärta, injicera karprofen i en dos på 5-10 mg/kg subkutant var 12-24:e timme baserat på en bedömning av smärta under en period av tre dagar.
- Ge djuret en veckas återhämtningsperiod innan du påbörjar några registrerings- eller experimentella procedurer.
5. Förfarande för registrering
- Hantera djuret i 15 minuter, två gånger dagligen, tre dagar i följd.
- Plocka upp mössen genom att försiktigt stänga handen runt dem utan att trycka för mycket.
- Placera huvudtage-brädan på djurets huvud i 30 minuter en gång om dagen i tre på varandra följande dagar.
- På inspelningsdagen ska du acklimatisera djuret till inspelningsrummet i 30 minuter.
- Placera djuret i en liten inspelningskammare i en Faraday-bur för att minska externa elektriska störningar. Fäst den anpassade headstage för inspelning.
- Öppna inspelningsprogramvaran och välj en samplingsfrekvens på 2,00 kHz. Inaktivera alla kanaler utom 13 och 20 genom att välja varje kanal och trycka på mellanslagstangenten.
- I fönstret för maskinvarubandbredd ställer du in den nedre bandbredden till 2 Hz och den övre bandbredden till 100 Hz.
- I programvarufiltreringsfönstret justerar du lågpassfiltret till 100 Hz och högpassfiltret till 2 Hz.
- Välj lagringssökväg genom att klicka på Välj filnamn och klicka sedan på Spela in.
- Börja varje registreringssession med en 10 minuters tillvänjningsperiod följt av en 15 minuters EEG-registrering vid baslinjen.
- Efter baslinjeregistreringen, administrera läkemedlet via intraperitoneal injektion och fortsätt spela in i ytterligare 30 minuter utan dröjsmål.
OBS: Se avsnittet Resultat för detaljer om de läkemedel som används.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultaten som visas här visar effekterna av flera läkemedel på egenskaperna hos lokala fältpotentialer (LFP) som testats i fyra kohorter av C57BL/6 hanmöss (n = 8 för varje kohort; ålder: 8 veckor; vikt: 24,0 ± 0,42 g). De läkemedel som testades var bland annat det antipsykotiska läkemedlet klozapin, kaliumkanalmodulatorerna 4-aminopyridin (4-AP) och retigabin, samt kontrollvehikeln koksaltlösning.
Som visas i figur 1 placerades musen i en liten inspelningskammare och LFP:er samlades in från hippocampus (HIP) och prefrontala cortex (PFC) med hjälp av ett specialdesignat huvudstage. Eftersom denna studie främst fokuserade på undersökningen av theta- och gammafrekvensbanden, genomgick den inspelade signalen först initial bandpassfiltrering inom ett frekvensområde på 2-100 Hz, följt av sampling vid 2000 Hz. Signalen delades sedan in i flera 2 s epoker. Alla epoker som uppvisade uttalade rörelseartefakter identifierades och uteslöts därefter från efterföljande analysprocesser. Effektspektra av LFP:er i både HIP och PFC samt HIP-PFC-koherensen mättes med hjälp av en multi-taper-baserad analysmetod9. Analysen använde fem Slepian-avsmalningar, och tidsbandbredden sattes till tre för att uppnå den optimala spektrala koncentrationen. Ett skjutfönster på 1 s och en stegstorlek på 100 ms användes för att generera tidsfrekvensspektrogrammen och tidsförloppet för HIP-PFC-koherensen.
Som visas i figur 2 och figur 3 gav administrering av koksaltlösning inga märkbara effekter på effektspektra för LFP:er i HIP och PFC, och inte heller HIP-PFC-koherens. Både retigabin och klozapin visade tydliga minskningar av gammabandets (30-100 Hz) effekt i HIP och PFC, liksom gammabandets HIP-PFC-koherens. Däremot uppvisade 4-AP de motsatta effekterna, kännetecknade av ökad gammabandseffekt i HIP och PFC, tillsammans med en ökad koherens inom gammabandet mellan HIP och PFC.
Figur 1: Schematisk bild av den experimentella uppställningen. Elektroder implanterades i hippocampus (HIP) och prefrontala cortex (PFC) för att registrera lokala fältpotentialer. Djuret placerades i en liten inspelningskammare och ett specialdesignat huvudsteg fästes vid elektrodkontakten. Varje inspelningssession inleddes med en 10 minuters baslinjesession, som följdes av en 30 minuters drogsession. Effekterna av koksaltlösning, klozapin, 4-AP och retigabin testades. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Effekten av antipsykotiska läkemedel och kaliumkanalmodulatorer på den pågående elektrofysiologiska aktiviteten i hippocampus (HIP) och prefrontala cortex (PFC). Det normaliserade spektrogrammet av de lokala fältpotentialerna i HIP och PFC, tillsammans med HIP-PFC-koherensen, uppvisade tidsberoende effekter för alla studerade läkemedel. Läkemedlen administrerades via intraperitoneal injektion vid tidpunkt t = 15 min. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Effekten av antipsykotiska läkemedel och kaliumkanalmodulatorer på effektspektradensiteten i HIP och PFC. 4-AP förbättrade signifikant gammabandskraften i båda hjärnregionerna, medan klozapin och retigabin undertryckte gammabandskraften i båda regionerna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet som presenteras här beskriver proceduren för att konstruera ett anpassat huvudsteg som är särskilt utformat för samtidig registrering av dubbla lokala fältpotentialer (LFP) i hippocampus (HIP) och prefrontala cortex (PFC). De detaljerade stegen i detta protokoll ger tillräckligt med information för att forskare ska kunna undersöka signalkommunikationen noggrant både inom varje region och mellan HIP och PFC.
Det specialdesignade headstage använder ett kommersiellt förstärkarchip. Medan den nuvarande konfigurationen stöder inspelning av 8 kanaler, kan headstage enkelt anpassas för att rymma hela 32-kanalskapaciteten, vilket ger potential för utökad kanalkapacitet som är lämplig för elektrodinspelning. Med tanke på den låga kostnaden för huvudscenen är ett alternativ att permanent fästa brädan på djurets huvud. Detta tillvägagångssätt ger fördelen att minimera rörelseartefakter och minska den totala störningsnivån som orsakas av rörelse.
Den specialtillverkade elektroden visar stabil långtidsregistrering av LFP:er och bibehåller god signalkvalitet under en period av 3-5 månader. Ett annat genomförbart tillvägagångssätt innebär att man använder polyimidbaserade flexibla kretskort som elektrodmatriser10,11. Dessa flexibla kretskort kan integreras med inspelningshuvudentage för att möjliggöra flerkanalig inspelning. Denna metod ger fördelen att förenkla elektrodberedning och kirurgiska ingrepp. Vikten på implantatet med och utan huvudstage är mycket lätt, 0,198 g respektive 0,812 g, vilket gör det lämpligt för mycket unga möss.
En begränsning med den nuvarande registreringstekniken är den potentiella störning som orsakas av den hängande kabeln, vilket kan störa djurets naturliga beteende under försök. För att lösa detta problem kan alternativa lösningar som att använda ett SD-kort för datalagring eller implementera en trådlös signalsändarmodul övervägas.
Ett viktigt och kritiskt steg i protokollet handlar om korrekt positionering av elektroden. Det är viktigt att säkerställa exakt och konsekvent elektrodplacering för att möjliggöra jämförbarhet mellan experiment. För att verifiera elektrodens placering måste histologi utföras12. En användbar teknik för att förbättra korrekt elektrodpositionering i HPC är att spela in medan elektroden är vertikalt införd, eftersom starka thetarytmer och neuronal avfyrning kommer att indikera korrekt placering. Det är tillrådligt att använda vuxna möss som är äldre än 8 veckor, eftersom signalkvaliteten kan försämras med tiden eller resultera i felaktig placering när mössen åldras. Att ta hänsyn till dessa överväganden kommer att bidra till att upprätthålla tillförlitligheten och validiteten hos de experimentella resultaten.
Sammanfattningsvis ger protokollet som presenteras i den här artikeln ett ramverk för att studera signalkommunikationen mellan olika hjärnregioner. Det gör det möjligt för forskare att utforska den neuronala dynamiken och interaktionerna inom och mellan dessa regioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Royal Melbourne Hospital Neuroscience Foundation (A2087).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brass tube | Albion Alloys, USA | Inside diameter of 0.45 mm | |
| Carprofen | Rimadyl, Pfizer Animal Health | ||
| Commercial amplifier chip | Intantech | RHD 2132 | |
| Control board | Intantech | RHD recording system | |
| Dental cement | Paladur | ||
| Heat shrinks | Panduit | 0.8 mm diameter | |
| M1.2 stainless steel screw | Watch tools | Clock and watch screw | |
| Multichannel socket connector | Harwin, AU | 1.27 mm pitch, PCB socket | |
| PFA-coated tungsten wires | A-M SYSTEMS, USA | Inside diameter of 150 µm | |
| Phosphoric acid-based flux | Chip Quik | CQ4LF-0.5 | |
| Recording software | Intantech | RHX recording software | |
| Stereotactic Frame | World Precision Instruments | Mouse stereotactic instrument | |
| Super glue | UHU | Ultra fast |
References
- Einevoll, G. T., Kayser, C., Logothetis, N. K., Panzeri, S. Modelling and analysis of local field potentials for studying the function of cortical circuits. Nat Rev Neurosci. 14 (11), 770-785 (2013).
- Buzsaki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents-EEG, ECOG, LFP and spikes. Nat Rev Neurosci. 13 (6), 407-420 (2012).
- Sigurdsson, T., Stark, K. L., Karayiorgou, M., Gogos, J. A., Gordon, J. A. Impaired hippocampal-prefrontal synchrony in a genetic mouse model of schizophrenia. Nature. 464 (7289), 763-767 (2010).
- Witton, J., et al. Disrupted hippocampal sharp-wave ripple-associated spike dynamics in a transgenic mouse model of dementia. J Physiol. 594 (16), 4615-4630 (2016).
- Englot, D. J., Konrad, P. E., Morgan, V. L. Regional and global connectivity disturbances in focal epilepsy, related neurocognitive sequelae, and potential mechanistic underpinnings. Epilepsia. 57 (10), 1546-1557 (2016).
- Pievani, M., De Haan, W., Wu, T., Seeley, W. W., Frisoni, G. B. Functional network disruption in the degenerative dementias. Lancet Neurol. 10 (9), 829-843 (2011).
- Sigurdsson, T., Duvarci, S. Hippocampal-prefrontal interactions in cognition, behavior and psychiatric disease. Front Syst Neurosci. 9, 190 (2015).
- Sun, D., et al. Effects of antipsychotic drugs and potassium channel modulators on spectral properties of local field potentials in mouse hippocampus and pre-frontal cortex. Neuropharmacology. 191, 108572 (2021).
- Bokil, H., Andrews, P., Kulkarni, J. E., Mehta, S., Mitra, P. P. Chronux: A platform for analyzing neural signals. J Neurosci Methods. 192 (1), 146-151 (2010).
- Bozkurt, A., Lal, A. Low-cost flexible printed circuit technology based microelectrode array for extracellular stimulation of the invertebrate locomotory system. Sens Actuator A Phys. 169 (1), 89-97 (2011).
- Du, P., et al. High-resolution mapping of in vivo gastrointestinal slow wave activity using flexible printed circuit board electrodes: Methodology and validation. Ann Biomed Eng. 37, 839-846 (2009).
- JoVE Science Education Database. Neuroscience. Histological Staining of Neural Tissue. JoVE. , (2023).
