Summary
Il protocollo chiarisce due distinte metodologie di decellularizzazione applicate ai tessuti polmonari bovini nativi, fornendo un resoconto completo delle rispettive caratterizzazioni.
Abstract
L'uso di idrogel derivati dalla matrice extracellulare (ECM) nell'ingegneria tissutale è diventato sempre più popolare, in quanto possono imitare l'ambiente naturale delle cellule in vitro. Tuttavia, mantenere il contenuto biochimico nativo dell'ECM, raggiungere la stabilità meccanica e comprendere l'impatto del processo di decellularizzazione sulle proprietà meccaniche degli idrogel dell'ECM sono impegnativi. In questo studio, sono stati descritti una pipeline per la decellularizzazione del tessuto polmonare bovino utilizzando due diversi protocolli, la caratterizzazione a valle dell'efficacia della decellularizzazione, la fabbricazione di idrogel ECM polmonari decellularizzati ricostituiti e la valutazione delle loro proprietà meccaniche e di citocompatibilità. La decellularizzazione del polmone bovino è stata perseguita utilizzando un metodo fisico (cicli di gelo-disgelo) o chimico (a base di detergenti). La colorazione con ematossilina ed eosina è stata eseguita per convalidare la decellularizzazione e la ritenzione dei principali componenti dell'ECM. Per la valutazione del contenuto residuo di collagene e glicosaminoglicani solfatati (sGAG) all'interno dei campioni decellularizzati, sono state impiegate rispettivamente le tecniche di colorazione del rosso Sirio e del blu Alciano. Le proprietà meccaniche degli idrogel ECM polmonari decellularizzati sono state caratterizzate dalla reologia oscillatoria. I risultati suggeriscono che gli idrogel polmonari bovini decellularizzati possono fornire un'alternativa organotipica affidabile ai prodotti ECM commerciali, conservando la maggior parte dei componenti nativi dell'ECM. Inoltre, questi risultati rivelano che il metodo di decellularizzazione scelto influisce in modo significativo sulla cinetica di gelificazione, nonché sulla rigidità e sulle proprietà viscoelastiche degli idrogel risultanti.
Introduction
Le condizioni convenzionali di coltura monostrato non offrono una rappresentazione fedele dei microambienti tissutali nativi e non sono in grado di fornire un'impalcatura tridimensionale (3D) con ligandi istruttivi che consentano le interazioni cellula-matrice e cellula-cellula1. La composizione della matrice extracellulare (ECM) e le proprietà meccaniche sono altamente tessuto-specifiche, tempo-dipendenti e subiscono alterazioni in condizioni patologiche. Pertanto, c'è bisogno di modelli tissutali 3D biomimetici che consentano la sintonizzabilità di tali caratteristiche, la modulazione del comportamento cellulare e il raggiungimento della funzionalità tissutale desiderata. I biomateriali nativi derivati dall'ECM attirano molta attenzione nell'ingegneria tissutale con la possibilità di utilizzare direttamente l'ECM 1,2,3,4,5 tessuto-specifico. I vettori basati su ECM sono stati utilizzati in molte applicazioni che vanno dalla rigenerazione tissutale allo sviluppo di modelli di malattia. Sono utilizzati come scaffold di biomateriali iniettabili o impiantabili 4,5, in applicazioni di screening farmacologico 6,7, nello sviluppo di materiali che inducono la crescita cellulare 8,9,10, come bio-inchiostri 11,12,13, in microfluidica 14 e in modelli di tessuto tumorale 15,16,17,18,19.
La decellularizzazione di tessuti e organi è un approccio popolare per la generazione di scaffold che imitano l'ECM tessuto-specifica. La ricostituzione di tessuti e organi decellularizzati in idrogel consente l'inclusione di cellule in modelli tissutali biomimetici3D 20. Le tecniche di decellularizzazione si concentrano principalmente sull'eliminazione dei componenti cellulari mantenendo la composizione dell'ECM. Metodi fisici come i cicli di gelo-disgelo o processi chimici come il trattamento Triton-X-100 sono comunemente applicati per decellularizzare i tessuti. Inoltre, il trattamento con DNasi è preferito per la rimozione del DNA residuo per ridurre al minimo le risposte immunologiche all'inclusione cellulare. È fondamentale ottenere la massima rimozione cellulare e la minima compromissione dell'ECM per ottimizzare le procedure di decellularizzazione21. Oltre a questi aspetti, la caratterizzazione delle proprietà biochimiche e meccaniche degli scaffold ricostituiti, tra cui la viscoelasticità e la rigidità, è fondamentale per migliorare i modelli tissutali 3D ingegnerizzati derivati da matrici native20.
L'ECM organo-specifica nell'ingegneria del tessuto polmonare consente di imitare il microambiente polmonare per modellare processi di sviluppo, omeostatici o patologici in vitro e testare terapie in un ambiente fisio-mimetico 20,22,23. Studi precedenti hanno dimostrato la decellularizzazione del tessuto polmonare di diverse specie, come ratti, suini ed esseri umani, ma questi metodi devono ancora essere adattati a specie meno utilizzate come i bovini. Una migliore comprensione dei parametri del processo di decellularizzazione e di come influenzano gli scaffold ECM ricostituiti risultanti per quanto riguarda la composizione biochimica e le proprietà meccaniche consentirà una migliore messa a punto di tali aspetti e aprirà la strada a modelli tissutali più affidabili in salute e malattia. In questo studio, la decellularizzazione del polmone bovino con due metodi distinti, cicli di gelo-disgelo e trattamento con Triton-X-100, è esplicitamente descritta e seguita da analisi biochimiche e meccaniche di idrogel ECM polmonari decellularizzati (dECM). I risultati rivelano che entrambi i metodi producono un'efficace decellularizzazione e ritenzione dei ligandi ECM. In particolare, la scelta del metodo altera significativamente la rigidità e la viscoelasticità risultanti degli idrogel ricostituiti. Gli idrogel derivati dalla dECM bovina dimostrano notevoli analogie biochimiche con la matrice extracellulare del polmone umano e presentano caratteristiche di gelificazione termica affidabili20. Come descritto in precedenza, entrambi i metodi sono adatti per la coltura 3D di cellule tumorali polmonari, cellule epiteliali bronchiali sane e organoidi polmonari derivati da pazienti20.
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Protocol
I polmoni autoctoni freschi di giovani (1-2 anni) donatori bovini sono stati ottenuti da un macello locale e trasportati in un contenitore di plastica sigillato su ghiaccio al laboratorio. Il sacrificio animale viene eseguito per il consumo generale di carne (polmoni scartati come rifiuti) e non è correlato o dovuto allo studio. Confermiamo che il macello è conforme alle leggi e ai regolamenti nazionali in materia di sacrifici animali. Inoltre, confermiamo di aver utilizzato solo materiale di scarto e che il progetto di ricerca non ha influito sul numero di animali sacrificati.
1. Prelievo di organi e preparazione dei tessuti
- Conservare i tessuti polmonari bovini appena ottenuti a -80 °C fino all'esperimento.
- Il giorno dell'esperimento, attendere che i tessuti polmonari congelati si scongelino a temperatura ambiente.
- Sezionare i tessuti con bisturi sterili e forbici per rimuovere la trachea e le vie aeree cartilaginee e tritare ulteriormente in piccoli pezzi (5 mm3).
- Lavare accuratamente con acqua ultrapura contenente il 2% di penicillina/streptomicina (P/S) almeno 3 volte.
2. Decellularizzazione dei tessuti
NOTA: I tessuti polmonari bovini nativi sono stati decellularizzati utilizzando due protocolli distinti.
- Metodo di congelamento-scongelamento
- Preparare i campioni di tessuto in base al passaggio 1. Immergere i fazzoletti tritati in una soluzione di iodio al 2% in acqua distillata sterile (dH2O) per 1 min. Eseguire due lavaggi consecutivi in dH2O sterile.
- Trasferire i pezzi di tessuto tritato in una provetta da 50 mL fino al livello di 15 mL e implementare cinque cicli manuali di congelamento-scongelamento utilizzando un contenitore portatile di azoto liquido. Riempire le provette fino all'orlo con dH2O sterili e congelare le provette per 2 minuti in azoto liquido. Dopo 2 minuti, trasferirli immediatamente a bagnomaria a 37 °C per 10 minuti. Si tratta di 1 ciclo di gelo-disgelo.
- Incubare i campioni con 30 mL di soluzione di DNasi (10 U/mL) in tampone 10 mM MgCl2 (pH 7,5) per 1 ora a 37 °C sotto agitazione costante a 100 giri/min.
- Continuare con un lavaggio prolungato con dH2O sterile per 3 giorni agitando costantemente a 100 giri/min, con reintegro della soluzione ogni 24 ore.
- Eseguire la liofilizzazione e la criomacinazione come segue20: Congelare i campioni dECM umidi a -80 °C per 24 ore. Trasferire i campioni congelati in un liofilizzatore e operare in modalità di essiccazione sotto vuoto per 3 o 4 giorni fino a completa essiccazione. Al termine della liofilizzazione, eseguire la macinazione dei campioni in una forma di polvere fine utilizzando un apparecchio di macinazione e ghiaccio secco.
NOTA: Questo stato di polvere fine è ritenuto necessario a causa delle sue proprietà di solubilità migliorate durante le fasi successive del processo di digestione.
- Metodo Triton-X-100
- Preparare i campioni di tessuto in base al passaggio 1. Trattare i tessuti polmonari con Triton-X-100 all'1% per 3 giorni in leggera rotazione a 4 °C. Sostituzione della soluzione ogni 24 ore.
- Incubare i campioni con soluzione di DNasi (10U/mL) in tampone 10 mM MgCl2 (pH 7,5) per 1 ora a 37 °C sotto agitazione costante.
- Proseguire con un lavaggio approfondito con dH2O sterile per 3 giorni a rotazione delicata, con reintegro della soluzione ogni 24 ore.
- Eseguire la liofilizzazione seguita dalla crio-macinazione come descritto al punto 2.1.
3. Digestione della pepsina
- Digerire campioni di dECM in polvere a una concentrazione di 15 mg/mL (p/v) in soluzione di pepsina (1 mg/mL di pepsina in HCl 0,01 M, pH 2). Eseguire il processo di digestione del campione a temperatura ambiente agitando costantemente per 48 ore e mantenere frequentemente il pH della soluzione per una digestione efficace.
- Trasferire i digestati in una provetta e centrifugare a 5000 x g per 10 min.
- Raccogliere il surnatante e neutralizzarlo e tamponarlo in condizioni fisiologiche (pH 7, 1x soluzione salina tampone fosfato (PBS)) attraverso l'aggiunta di 5M NaOH e 10x PBS.
NOTA: Si consiglia di utilizzare soluzioni alcaline concentrate per la regolazione del pH del digestato acido, in quanto questo approccio evita un'espansione di volume indesiderata che potrebbe influire negativamente sulla gelificazione nelle fasi successive. - Conservare i digestati pre-gel a −20 °C per ulteriori studi.
4. Colorazione istologica
- Fissare una piccola porzione (5mm3) di campione di tessuto decellularizzato in 1 mL di soluzione di formaldeide al 3,7% a 4 °C per una notte.
- Incubare i tessuti in provette contenenti 1 ml di soluzione di saccarosio al 30% in PBS per 12 ore a 4 °C su roccia stabile.
- Per incorporare i tessuti nel composto a temperatura di taglio ottimale (OCT), versare 1 mL di OCT in un criostampo, posizionare il tessuto al centro del criostampo, quindi versare 2 ml di OCT sopra il tessuto.
- Posizionare i criostampi contenenti tessuti su ghiaccio secco e congelare a scatto utilizzando azoto liquido. I campioni sono pronti quando l'OCT diventa tutto bianco, il che di solito richiede 3 minuti. Conservare i fazzoletti OCT a -20 °C fino all'uso.
- Ottenere sezioni di 10 μm nel criostato a -25 °C su un vetrino rivestito di poli-L-lisina e trasferire il vetrino a temperatura ambiente per consentire alla sezione di tessuto di fondersi sul vetrino. Conservare i vetrini a -20 °C fino all'utilizzo.
- Per confermare l'assenza di nuclei dopo la decellularizzazione, eseguire una colorazione con ematossilina ed eosina (H&E) come descritto di seguito.
- Incubare i vetrini a temperatura ambiente per 10 min. Immergere i vetrini in PBS e colorarli con 50 ml di soluzione di ematossilina pronta all'uso in un barattolo colorante per 3 minuti, seguita da un lavaggio di 3 minuti con acqua di rubinetto.
- Immergere i vetrini in etanolo al 95% e colorare con 50 ml di soluzione alcolica di eosina allo 0,5% in un barattolo colorante per 45 secondi.
- Eseguire la colorazione rosso Sirius per mostrare la ritenzione del contenuto di collagene dopo la decellularizzazione.
- Idratare i vetrini con PBS e immergerli in 50 ml di rosso Sirio allo 0,1% in una soluzione acquosa satura di acido picrico in un barattolo colorante per 1 ora.
- Sciacquare i vetrini in una soluzione di acido acetico allo 0,5% per 5 secondi e disidratare tutti i vetrini immergendoli in etanolo al 70%, 95% e 100% in sequenza per 1 minuto ciascuno.
- Per analizzare il contenuto di sGAG nei campioni di tessuto, eseguire la colorazione blu Alcian come descritto di seguito.
- Immergere i vetrini in 50 ml di blu di Alcian all'1% in una soluzione di acido acetico al 3% (pH 2,5) in un barattolo colorante per 30 minuti. Lavare i vetrini con acqua corrente del rubinetto per 2 min.
- Disidratare tutti i vetrini immergendoli in etanolo al 70%, 95% e 100% in sequenza per 1 minuto ciascuno.
- Aggiungere 0,1 mL di terreno di montaggio sopra i campioni e visualizzare utilizzando la microscopia ottica con ingrandimento 10x.
5. Caratterizzazione meccanica
- Implementare misure reologiche oscillatorie utilizzando un reometro con geometria a piastre parallele.
- Versare 250 μL di soluzione pre-gel mantenuta in ghiaccio su una piastra inferiore preraffreddata (4 °C) per evitare una rapida gelificazione.
- Abbassare la piastra parallela di 20 mm fino a quando la soluzione pre-gel forma un disco con una distanza di 1 mm tra le due piastre.
- Avviare immediatamente la misurazione. Misurare i moduli di stoccaggio e perdita nel tempo con una frequenza e una deformazione fisse mentre si riscalda la piastra inferiore a 37 °C per 30 minuti per osservare la cinetica di gelificazione. Utilizzare una frequenza fissa di 0,5 Hz e una deformazione dello 0,1%.
- Eseguire un test di recupero dello scorrimento dopo che il valore del modulo di memorizzazione smette di aumentare e raggiunge un plateau.
- Applicare una sollecitazione di taglio di 1 Pa all'idrogel per 15 minuti, misurare la deformazione, scaricare il campione dalla sollecitazione e registrare la variazione del valore di deformazione per 15 minuti.
- Disegna un grafico della tensione in funzione del tempo per mostrare il comportamento di rilassamento dello stress. Ripetere le misurazioni per tre diversi digest dECM come repliche.
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Representative Results
Decellularizzazione
La decellularizzazione del tessuto polmonare bovino per produrre idrogel dECM che ricapitolerebbero il microambiente polmonare nativo è stata ottenuta sia con metodi fisici (congelamento-disgelo) che chimici (Triton-X-100). Dopo la dissezione, i pezzi di tessuto sono stati lavati in antibiotici contenenti dH2O per rimuovere gli agenti patogeni che possono successivamente influenzare la sterilità degli idrogel dECM. Un totale di cinque cicli alternati tra azoto liquido e bagno d'acqua a 37 °C è stato applicato per il metodo di congelamento-disgelo per distruggere le strutture cellulari. Nel secondo metodo di decellularizzazione, pezzi di tessuto polmonare nativo sono stati trattati con una soluzione di Triton-X-100 all'1% per 3 giorni in costante agitazione. In entrambi i metodi, il taglio del tessuto polmonare in piccoli pezzi è fondamentale per consentire la diffusione delle soluzioni alle regioni centrali e l'interruzione fisica del contenuto nucleare. Come primo indicatore visivo di decellularizzazione, il colore rosa del tessuto si è trasformato in un colore biancastro con cicli ripetuti in entrambi i metodi. È anche fondamentale rimuovere il DNA residuo, che è stato ottenuto con il trattamento con DNasi in questo protocollo. Inoltre, dopo la decellularizzazione con entrambi i metodi, i tessuti sono stati ampiamente lavati per 3 giorni in dH2O integrato con antibiotici per preservare la sterilità dei tessuti. Un altro punto da considerare è che durante la neutralizzazione e il tamponamento dei digestati dECM in condizioni fisiologiche, tutte le soluzioni sono state sterilizzate con filtro, sempre per scopi di sterilità, e mantenute in ghiaccio per evitare la formazione prematura di gel. La formazione di idrogel polmonare dECM è stata quindi ottenuta con la gelificazione termica nella fase finale (Figura 1).
Crio-sezionamento e colorazioni istologiche
Sono state eseguite fissazioni e crio-sezionamento di tessuti polmonari nativi e decellularizzati, seguite da colorazioni istologiche indicate, per valutare l'eliminazione dei nuclei e la ritenzione delle molecole di ECM dopo la decellularizzazione (Figura 2A). La colorazione H&E ha dimostrato una significativa riduzione del contenuto di nuclei nei campioni decellularizzati con metodi di congelamento-scongelamento e Triton-X-100 rispetto al tessuto nativo, il che implica che la decellularizzazione è stata ottenuta sia con metodi fisici che chimici (Figura 2B). La colorazione rossa di Sirius ha mostrato che il collagene trattenuto nei tessuti decellularizzati era paragonabile al tessuto nativo, indicando che entrambi i metodi di decellularizzazione hanno avuto un impatto minimo sul contenuto di collagene (Figura 2B). Inoltre, la colorazione blu di Alcian ha dimostrato che il contenuto di sGAG nei tessuti decellularizzati è stato preservato in modo efficiente rispetto ai tessuti nativi (Figura 2B).
Caratterizzazione meccanica
Le misurazioni reologiche degli idrogel polmonari decellularizzati sono state effettuate con una piastra parallela da 20 mm per ottenere un disco idrogel di 1 mm di spessore (Figura 3A). Lo sweep di frequenza è stato utilizzato per ottimizzare i valori di deformazione utilizzati nelle misurazioni. Il modulo medio di conservazione (G') e il modulo di perdita (G'') degli idrogel ottenuti con il metodo del congelamento-disgelo erano rispettivamente di 204 Pa e 28,4 Pa, che erano significativamente più rigidi degli idrogel ottenuti con il metodo Triton-X-100 (Figura 3B-C). È interessante notare che i test di recupero del creep hanno mostrato che gli idrogel ottenuti con i metodi di congelamento-disgelo e Triton-X-100 hanno avuto risposte distinte allo stress, implicando che gli idrogel hanno proprietà viscoelastiche diverse (Figura 3D).
Figura 1: Rappresentazione schematica del processo di decellularizzazione. Il tessuto polmonare bovino è stato sezionato in piccoli pezzi e lavato accuratamente. La rimozione del contenuto cellulare è stata ottenuta con due metodi diversi. Metodo fisico con cicli ripetuti di gelo-disgelo e metodo chimico con trattamento Triton-X-100. Il trattamento con DNasi è stato eseguito in entrambi i metodi per rimuovere il DNA residuo; Dopo la liofilizzazione dei tessuti decellularizzati, sono state seguite le fasi di criomacinazione, digestione della pepsina, neutralizzazione e gelificazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Crio-sezionamento e colorazione di tessuti polmonari bovini nativi e decellularizzati. (A) Pezzi di tessuto polmonare bovino nativo e decellularizzato sono stati fissati con una soluzione di formaldeide al 3,7%, immersi in una soluzione di saccarosio al 30% in PBS, quindi incorporati in un composto a temperatura di taglio ottimale (OCT) e congelati. Per ogni campione, sezioni di 10 μm sono state montate su vetrini per procedere con la colorazione. (B) Immagini rappresentative di campioni nativi e decellularizzati con metodi di congelamento-disgelo o Triton-X-100. Sono state eseguite la colorazione con ematossilina ed eosina (H&E) per i nuclei, la colorazione con il rosso Sirius per il collagene e la colorazione con il blu di Alcian per gli sGAG. Barra graduata: 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Misura delle proprietà meccaniche di idrogel ECM polmonari decellularizzati. (A) Immagine rappresentativa di un idrogel polmonare decellularizzato termoreticolato dopo caratterizzazione meccanica. La reologia oscillatoria è stata eseguita utilizzando un reometro con geometria a piastre parallele. Proprietà reologiche di idrogel decellularizzati, (B) modulo di accumulo (G'), (C) modulo di perdita (G''), (D) test di creep-recovery per valutare il comportamento di rilassamento dello stress degli idrogel. Le barre di errore rappresentano s.d. (*p < 0,05), n=3. Per l'analisi statistica è stato utilizzato un test t non accoppiato con la correzione di Welch. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Gli idrogel derivati da organi sono diventati modelli promettenti che ricapitolano l'ECM tissutale nativa e imitano la funzione cellulare organotipica. Sebbene l'ECM polmonare decellularizzata sia stata spesso utilizzata nell'ingegneria tissutale, una caratterizzazione approfondita della composizione del biomateriale e delle proprietà meccaniche favorirà una migliore comprensione di come le interazioni cellula-ECM possono essere modulate per modellare i processi biologici durante l'omeostasi o la malattia. In particolare, la valutazione e il controllo delle proprietà meccaniche degli idrogel ricostituiti, come la rigidità e la viscoelasticità, riveste grande importanza in quanto queste sono state implicate nella regolazione di diversi fenomeni cellulari. Pertanto, è fondamentale confrontare e valutare diversi metodi di decellularizzazione per la produzione di idrogel dECM in termini di contenuto biochimico e aspetti meccanici20,23. In questo caso, la decellularizzazione del polmone bovino è stata dimostrata con due approcci distinti: cicli di congelamento-disgelo, basati principalmente sulla distruzione meccanica e sulla rimozione del contenuto di DNA, nonché sulla rimozione chimica del contenuto nucleare utilizzando un comune detergente, Triton-X-100 (Figura 1). Per il metodo di congelamento-scongelamento, è essenziale garantire che tutti i campioni di tessuto siano congelati e scongelati in modo appropriato tra azoto liquido e bagno d'acqua in un percorso automatizzato e ripetitivo24. Per raggiungere questo obiettivo, i campioni di tessuto potrebbero essere divisi in diverse provette e affondati nel contenitore dell'azoto per il congelamento e quindi in un bagno d'acqua per lo scongelamento. Cambiare la soluzione Triton-X-100 ogni 24 ore è fondamentale affinché il metodo chimico interrompa efficacemente il contenuto cellulare21. Il trattamento con DNasi è stato utilizzato in entrambi i metodi per migliorare ulteriormente la scomposizione del DNA rimanente, che potrebbe ridurre la vitalità delle cellule incapsulate. Entrambi i metodi hanno eliminato con successo il materiale cellulare durante la decellularizzazione, con tracce di DNA rimanenti in entrambi i casi20. In particolare, è stato riportato che i prodotti a matrice extracellulare disponibili in commercio contengono piccole quantità di DNA residuo senza effetti avversi sulla citocompatibilità o sulle risposte immunitarie negli ospiti al momento dell'impianto per il loro uso nell'ingegneria tissutale e negli studi traslazionali20,25.
L'ECM comprende molte macromolecole proteiche e polisaccaridiche, come collageni, elastine e proteoglicani, che hanno ruoli regolatori critici nella segnalazione cellulare26. Pertanto, gli scaffold nativi derivati da ECM dovrebbero dimostrare la ritenzione di tali ligandi ECM istruttivi per le cellule. A questo scopo, sono state eseguite colorazioni di collagene e sGAG per confrontare la composizione ECM di matrici decellularizzate con quella dei tessuti nativi. I risultati mostrano che il contenuto di collagene e sGAG è stato trattenuto nei tessuti decellularizzati tramite metodi di congelamento-disgelo e decellularizzazione Triton-X-100, suggerendo che offrono un microambiente ECM simile a quello nativo negli scaffold ricostituiti20,26. L'organizzazione strutturale dei costituenti dell'ECM ha mostrato differenze secondo il metodo di decellularizzazione, nonostante lievi differenze nel contenuto di ECM. Anche se le immagini rappresentative hanno mostrato una maggiore somiglianza tra la decellularizzazione del tessuto polmonare basata su detergenti e le colorazioni del tessuto polmonare nativo, entrambi i protocolli hanno mantenuto con successo le proteine ECM native nel complesso (Figura 2).
Le proprietà meccaniche dei modelli tissutali 3D svolgono un ruolo cruciale negli studi sulle colture cellulari poiché sia la crescita che il comportamento delle cellule sono altamente indicati dalle caratteristiche meccaniche dell'ECM nativo 27,28,29,30. Vari metodi di decellularizzazione mostrano impatti distinti sul processo di gelificazione e sulla rigidità finale e sulla viscoelasticità degli idrogel dECM. Questi risultati dimostrano che il metodo di congelamento-disgelo produce idrogel più robusti e più rigidi rispetto al metodo Triton-X-100. Inoltre, nel nostro studio precedente, abbiamo dimostrato che la rigidità degli idrogel dECM congelati-scongelati può essere regolata modificando la concentrazione del ligando e può essere abbassata per corrispondere alla rigidità degli idrogel dECM derivati da Triton-X-10020. La viscoelasticità è una caratteristica delle matrici tissutali native che indica il comportamento viscoso ed elastico in risposta alla deformazione meccanica. Studi recenti hanno rivelato il ruolo della viscoelasticità dell'ECM nella proliferazione, morfologia e differenziazione cellulare29,30. Questo studio mostra gli idrogel polmonari dECM come materiali che rilassano lo stress simili alla fibrina nativa, al collagene o alla membrana basale ricostituita. Inoltre, i risultati indicano che gli idrogel dECM derivati dal metodo Triton-X-100 si riprendono più velocemente degli idrogel derivati dal gelo-disgelo. Pertanto, la scelta del metodo di decellularizzazione influisce fortemente sulla risposta al creep e sulla cinetica di rilassamento dei gel dECM risultanti.
I metodi di decellularizzazione qui descritti utilizzano il polmone bovino per ricostituire le caratteristiche biochimiche e meccaniche dell'ECM del tessuto polmonare. Abbiamo caratterizzato finemente la composizione biochimica e fisica dell'ECM dopo il processo di decellularizzazione. Una delle principali sfide nei metodi di decellularizzazione è la conservazione della composizione dell'ECM, che influisce direttamente sulla capacità di gelificazione degli idrogel dECM tra i lotti. L'utilizzo di tessuto polmonare dello stesso donatore è un parametro importante per superare la variabilità da lotto a lotto. Anche se sono stati utilizzati tessuti nativi sani, la variabilità tra i donatori è inevitabile. Nel complesso, entrambi i metodi di congelamento-disgelo e Triton-X-100 mostrano un potenziale promettente per l'utilizzo di idrogel dECM nativi nella modellazione della malattia del polmone.
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Disclosures
Tutti gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dal Consiglio per la ricerca scientifica e tecnologica della Turchia (TÜBİTAK) (sovvenzione n. 118C238). L'intera responsabilità della pubblicazione/articolo appartiene al proprietario della pubblicazione. Il sostegno finanziario ricevuto da TÜBİTAK non significa che il contenuto della pubblicazione sia approvato in senso scientifico da TÜBİTAK. Gli autori riconoscono con gratitudine l'uso dei servizi e delle strutture del Centro di ricerca per la medicina traslazionale dell'Università di Koç (KUTTAM). La Figura 1 e la Figura 2a sono state create utilizzando Biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absolute ethanol | ISOLAB | 64-17-5 | |
| Acetic acid | ISOLAB | 64-19-7 | |
| Alcian blue solution | Sigma-Aldrich | B8438 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Discovery HR-2 rheometer | TA Instruments | ||
| Entellan mounting medium | Merck | 107960 | |
| Eosin solution | Bright-slide | 2.BS01-105-1000 | |
| Formaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 50-980-485 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 100317 | |
| Iodine | Sigma-Aldrich | 3002 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
| Mayer's haematoxylin staining solution | Merck | 2.BS01-103-1000 | |
| O.C.T compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biowest | L0018-100 | |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma-Aldrich | P6887 | |
| Picric acid | Polysciences | 88-89-1 | |
| Sirius Red | Polysciences | 09400-25 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Triton-X-100 | Merck | 112298 |
References
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