Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Farelerin Altı Arka Bacak Kasının Enzimatik Ayrışmasıyla Elde Edilen Sağlam Kısa, Orta ve Uzun İskelet Kası Lifleri: Fleksör Digitorum Brevis'in Ötesinde

Published: December 1, 2023 doi: 10.3791/65851
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Physiology and Biochemistry Research Group-PHYSIS, Faculty of Medicine, University of Antioquia
* These authors contributed equally

Summary

Yetişkin farelerin altı kasından farklı uzunluk ve tiplerde enzimatik olarak ayrışmış lifler elde etmek için bir protokol tarif ediyoruz: bunlardan üçü daha önce tarif edildi (fleksör digitorum brevis, ekstansör digitorum longus, soleus) ve üçü ilk kez başarılı bir şekilde ayrıştı (ekstansör hallusis longus, peroneus longus, peroneus digiti quarti).

Abstract

Fare kaslarının enzimatik ayrışması ile elde edilen iskelet kası lifleri, fizyolojik deneyler için yararlı bir modeldir. Bununla birlikte, çoğu makale, lif türleri ile ilgili sonuçların kapsamını kısıtlayan, mevcut biyolojik materyal miktarını sınırlayan ve hücresel fizyolojik fenomenler ile diğer kaslarda elde edilen önceki biyokimyasal ve dinamik bilgiler arasında açık bir bağlantıyı engelleyen fleksör digitorum brevis'in (FDB) kısa lifleri ile ilgilidir.

Bu makale, farklı lif tipi profillere ve uzunluklara sahip altı kastan sağlam liflerin nasıl elde edileceğini açıklamaktadır. C57BL/6 yetişkin fareleri kullanarak, kas diseksiyonu ve lif izolasyon protokolünü gösteriyoruz ve liflerin Ca2+ geçici çalışmalar için uygunluğunu ve morfometrik karakterizasyonunu gösteriyoruz. Kasların lif tipi bileşimi de sunulmaktadır. Ayrıştığında, tüm kaslar sağlam, 24 saatten fazla hızlı bir şekilde kasılan canlı lifler haline gelir. FDB kısa (<1 mm), peroneus digiti quarti (PDQA) ve peroneus longus (PL) orta (1-3 mm) verirken, ekstansör digitorum longus (EDL), ekstansör hallusis longus (EHL) ve soleus kasları uzun (3-6 mm) lifleri serbest bıraktı.

Hızlı boya Mag-Fluo-4 ile kaydedildiğinde, PDQA, PL ve EHL liflerinin Ca2+ geçişleri, tip IIX ve IIB liflerine karşılık geldiği bilinen tip II (MT-II) morfolojisini anımsatan hızlı, dar kinetik gösterdi. Bu, bu kasların FDB (~% 80) ve soleus (~% 65) ile karşılaştırıldığında% 90'dan fazla tip II liflere sahip olduğu gerçeğiyle tutarlıdır. FDB'nin ötesine geçerek, ilk kez 1 ila 6 mm arasında değişen uzunluklarda lifler oluşturan birkaç kasın ayrışmasını gösteriyoruz. Bu lifler canlıdır ve hızlı Ca2+ geçişleri verir, bu da MT-II'nin kas kaynaklarından bağımsız olarak IIX ve IIB hızlı liflere genelleştirilebileceğini gösterir. Bu sonuçlar, olgun iskelet kası çalışmaları için modellerin kullanılabilirliğini arttırmaktadır.

Introduction

Memelilerin olgun iskelet kası çok işlevli bir dokudur. Metabolizmayı yoğun bir şekilde düzenler, ısı üretiminin ana kaynağıdır ve dinamik özellikleri ona solunumda, vücut bölümlerinin hareketinde veya bir noktadan diğerine yer değiştirmede önemli bir rol verir 1,2,3. İskelet kası, miyopatiler, distrofiler veya sarkopeni gibi kalıtsal ve kronik durumların yanı sıra kardiyometabolik hastalıklar 3,4,5,6,7,8 gibi birçok kas dışı kronik durum da dahil olmak üzere birçok hastalığın patofizyolojisi ile de ilgilidir.

Sağlık ve hastalık bağlamında olgun iskelet kasının yapısal ve fonksiyonel özelliklerinin ex vivo çalışması, esas olarak iki deneysel model aracılığıyla mümkün olmuştur: tüm kas ve izole lifler. 20. yüzyılda araştırmacılar, motor üniteler, lif tipleri ve kasılma ve gevşeme kuvveti ve kinetiği gibi dinamik özellikler hakkında bilgi edinmek için farklı küçük türlerin bütün, bozulmamış ekstansör digitorum longus (EDL), soleus, tibialis anterior ve gastroknemius kaslarının özelliklerini önemli modeller olarak kullandılar 9,10,11,12,13,14,15,16. Bununla birlikte, daha rafine hücre biyolojisi çalışmalarının ortaya çıkışı, alanı tek kas liflerinin incelenmesine doğru kaydırdı. Öncü çalışma daha sonra sıçanların bozulmamış fleksör digitorum brevis (FDB) liflerinin enzimatik ayrışma yoluyla daha sonraki karakterizasyon için izolasyonunu sağladı 17,18,19. FDB lifleri manuel diseksiyon20 ile de elde edilebilse de, çeşitli deneysel yaklaşımlara uygunluklarına ek olarak, murin kaslarının enzimatik ayrışmasının kolaylığı ve yüksek verimi, ikinci modelin son yirmi yılda yaygın olarak kullanılmasını sağlamıştır.

Kısa FDB lifleri, elektrofizyolojik ve diğer biyofiziksel çalışmalar, biyokimyasal, metabolik ve farmakolojik analizler, elektron ve floresan mikroskobu deneyleri, hücre biyolojisi yaklaşımları için transfeksiyon veya miyogenez çalışmalarında kök hücre kaynağı olarak uygundur 5,21,22,23,24,25,26,27,28, 29,30,31,32. Bununla birlikte, kas deneylerinde sadece FDB liflerinin kullanılması, lif türleriyle ilgili araştırmaların kapsamını daraltır ve bazı metodolojik teknikler veya bir hayvandan daha fazla bilgi edinmek için mevcut biyolojik materyal miktarını sınırlar. Bu sınırlamalar, hücresel fizyolojik fenomenlerin farklı bütün, sağlam kaslarda (örneğin, EDL, soleus, peronei) gerçekleştirilen önceki biyokimyasal ve dinamik çalışmalarla açık bir korelasyonunu engellemektedir.

Bu sınırlamaların üstesinden gelen bazı gruplar, daha uzun EDL ve soleus kaslarını 24,33,34,35,36,37,38,39,40 ayırmayı başardı ve yöntemi diğer ilgili kaslara daha da genişletmek için kapıyı açtı. Bununla birlikte, EDL ve soleus liflerinin kullanımı, muhtemelen onları bozulmamış lifler olarak elde etmek için metodolojik ayrıntıların bulunmamasından dolayı hala azdır. Burada, farklı uzunluk ve tipteki liflerin altı kastan nasıl izole edileceğini ayrıntılı olarak açıklıyoruz: bunlardan üçü daha önce tanımlanmış (FDB, EDL ve soleus) ve üçü ilk kez başarılı bir şekilde ayrıştı (ekstansör hallusis longus [EHL], peroneus longus [PL] ve peroneus digiti quarti [PDQA]). Bu çalışmanın sonuçları, enzimatik olarak ayrışmış liflerin modelinin çok çeşitli çalışmalar ve daha önce yayınlanmış verilerle gelecekteki korelasyonlar için uygun olduğunu ve böylece olgun iskelet kası çalışmaları için modellerin kullanılabilirliğini artırdığını doğrulamaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm prosedürler, Antioquia Üniversitesi (UdeA) Hayvanlarla Deneylerde Etik Komitesi tarafından (21 Haziran 2016 tarihli 104 ve 15 Nisan 2021 tarihli 005 sayılı tutanaklar), Kolombiya Hükümeti tarafından yayınlanan 84 tarihli 84 sayılı Kanun ve 1993 tarihli 8430 sayılı Karara göre onaylandı ve Hayvan Araştırmalarına uygun olarak gerçekleştirildi ve raporlandı: In Vivo Deneylerin Raporlanması (ARRIVE) kılavuzları41. Burada sunulan tüm sonuçlar sağlıklı, 7-13 haftalık, 20-26 g, C57BL/6 erkek farelerden gelmektedir. Şekil 1, bu çalışmanın genel tasarımını ve prosedürlerin sırasını göstermektedir. Tüm reaktifler, malzemeler ve ekipman ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Hayvanlar

  1. Kontrollü sıcaklık (21 ± 2 °C) ve ışık: karanlık (12:12 saat) döngüleri koşulları altında, ahşap türevli yataklı, akrilik, şeffaf, dikdörtgen kafes başına en fazla altı fare barındırın.
  2. Hayvanlara, çevresel zenginleştirme olmaksızın belirli patojen içermeyen hayvan tesislerinde yiyecek ve musluk suyuna ücretsiz erişim sağlayın.

2. Diseksiyon

  1. Çözeltiler, malzemeler ve reaktifler
    1. Çalışma çözeltilerini aşağıdaki bileşimle hazırlayın ve filtreleyin (0.22 μm) (tüm konsantrasyonlar mM cinsinden):
      1. Tirol: 5.4 KCl, 1 MgCl2, 140 NaCl, 0.33 NaH2PO4, 2 CaCl2, 10 glikoz, 10 HEPES, pH 7.3
      2. Ayrışma: 2.7 KCl, 1.2 KH2PO4, 0.5 MgCl2, 138 NaCl, 0.1 Na2HPO4, 1 CaCl2, pH 7.4
      3. Fosfat tamponlu salin (PBS): 137 NaCl, 8.6Na2HPO4, 2.8 KH2PO4, pH 7.34
    2. İki diseksiyon odası hazırlayın; stereoskop; ameliyat makası; ince makas; ince forseps; ve temiz, şeffaf, konik olmayan, 1-1.5 cm genişliğinde, kapaklı toplam hacmi 3-4 mL olan cam şişeler. Diseksiyon odalarındaki kasları elektriksel olarak uyarmak için bir sistem düzenleyin.
    3. Farklı genişlikte uçlara sahip ateşle parlatılmış Pasteur cam pipetler hazırlayın: 5, 4, 3, 2 ve 1 mm.
    4. Su banyosunu 37 °C'ye ayarlayın. 3 mg kollajenaz tip 2'nin alikotlarını tartın.
  2. Prosedür
    1. Yerel Etik Kurul tarafından onaylanan yöntemleri kullanarak fareyi kurban edin. Servikal çıkık, hızlı, daha az stresli olduğu ve kas dokusunu etkileyebilecek ilaçlara (CO2 veya bazı anestezikler gibi) maruz kalmayı önlediği için önerilir. Daha iyi sonuçlar elde etmek için hemen diseksiyona başlayın.
    2. Fareyi köpük bir yüzeye yerleştirin ve ön ayakları bantlayın veya sabitleyin. Her iki arka ayağı da ameliyat makası ile dizlerin üzerinden kesin, her birini ayrı bir diseksiyon odasına aktarın ve dokuyu kaplamak için soğuk (10-20 °C) Tyrode ekleyin.
      NOT: Her arka bacak aşağıdaki sırayla altı farklı kas verecektir: FDB, soleus, EDL, EHL, PL ve PDQA. Tendondan tendona sağlam altı kası incelemek için ayrıntılı anatomik referanslar Şekil 2'de ve başkayerlerde verilmiştir 42.
    3. İlk arka ayağı, bacakların arka yüzünün görülebileceği bir pozisyonda diseksiyon odasına sabitleyin. Cildi büyütme altında çıkarın; ardından FDB'yi açığa çıkarın ve çıkarın (Şekil 2). 1 mL Tyrode çözeltisi ile etiketli bir cam şişede saklayın.
      NOT: Kas dokusunda istenmeyen herhangi bir kesiyi önlemek için uygun büyütme ve önceden eğitim gereklidir.
    4. Soleus'u açığa çıkarın, çıkarın ve 1 mL Tyrode ile ayrı bir şişede saklayın. Şekil 2'de gösterildiği gibi, önce gastroknemius'u ayırmak ve ardından soleus'u çıkarmak için ince makas kullanın.
    5. Bacağın ön yüzünü ortaya çıkarın, cildi çıkarın ve tibialis anteriorunun distal tendonlarını ve ayak bileğindeki EDL kaslarını tanımlayın. Tibialis'i çıkarın ve atın; daha sonra EDL'nin distal tendonlarını kesin (Şekil 2). EDL'yi çıkarana kadar diseksiyona devam edin ve 1 mL Tyrode ile ayrı bir cam şişeye koyun.
    6. EDL'nin hemen arkasında ve medialinde yer alan EHL kasını çıkarın. Şekil 2'nin ilgili panelinde gösterildiği gibi, tendonu 1. basamağa kadar tanımlayarak ve takip ederek diseksiyona başlayın. Kasları 1 mL Tyrode ile ayrı bir cam şişede saklayın.
    7. Kesmek ve PL kasını çıkarmak için peronei'nin en dış tendonunu tanımlayın ve takip edin (Şekil 2). Kası 1 mL Tyrode ile ayrı bir cam şişeye yerleştirin.
    8. Tendonu tanımlayın ve 4. basamağa kadar takip edin; kesin ve PDQA kasını çıkarın (Şekil 2). 1 mL Tyrode ile ayrı bir cam şişeye koyun.
    9. İşlemi ikinci arka bacak ile tekrarlayın.
    10. Aynı tipteki her iki kası da etiketli bir cam şişede veya Tyrode solüsyonu içeren küçük bir Petri kabında toplayın.
      NOT: Bir çalışma seansı sırasında ikiden fazla kas çiftinin diseke edilmesi planlanıyorsa, diseksiyon prosedürü için iki araştırmacı görevlendirin.

3. Kas lifi izolasyon protokolü

  1. Kalıntıları ve fare kürkünü temizlemek için diseksiyon odalarındaki Tyrode solüsyonunu yenileyin. FDB kaslarını bir diseksiyon odasına dökün, bütünlüklerini doğrulayın ve 1 mL ayrışma solüsyonu ile yeni bir cam şişeye aktarın. Bu prosedürü EHL, PL ve PDQA kasları ile tekrarlayın.
    NOT: Bir kas aşırı kasılmış, kesilmiş görünüyorsa veya elektriksel stimülasyona yanıt vermiyorsa, bir sonraki protokol adımına devam etmeyin. Bunun yerine, solüsyonların kalitesini (pH, kontaminasyon, ozmolarite) doğrulayarak ve daha fazla diseksiyon becerisi kazanarak diseksiyon protokolünü optimize edin (Şekil 1C ve Ek Video S1).
  2. Liflerin oryantasyonunu takip ederek soleus ve EDL kaslarına uzunlamasına veya çapraz kesimler yapın (Şekil 2). Soleus için, uzunluğunun ~% 80'ini keserek merkezi tendonu takip edin. EDL için, sadece bir veya iki tendonu takip edin ve soleus ile aynı uzunlukta kesin. Her bir kas çiftini 1 mL ayrışma solüsyonu ile cam şişelere koyun.
    NOT: Bu prosedür EDL ve soleusu küçültür ve kollajenazın dokuya daha iyi girmesini sağlar. Yeterli büyütme (40-50x), ince makas ve forseps zorunludur. Ayrışma protokolünün bir sonraki adımına geçmeden önce her zaman görsel inceleme ve elektriksel stimülasyon ile numune bütünlüğünü kontrol edin.
  3. 1 mL ayrışma çözeltisi ve bir çift kas içeren her şişeye 3 mg kollajenaz tip 2 (250-300 U / mg aktivite ile) ekleyin. Kullanılan enzim partisinin aktivitesini göz önünde bulundurarak tam kollajenaz miktarını standartlaştırın.
  4. Kas çiftlerini su banyosunda 36.8-37 ° C'de 65-90 dakika hafifçe çalkalayarak inkübe edin.
    NOT: Sıcaklık kontrolü konusunda titiz olun. Hasarı önlemek için kasların 100 dakikadan fazla kollajenaz içinde kalmaması için prosedürü standartlaştırın.
  5. İnkübasyonun 65. dakikasından sonra her 5 dakikada bir stereoskop büyütme altındaki şişeleri kontrol edin. Kaslar hafifçe dalgalı, düzensiz ve gevşek göründüğünde, şişeyi hafifçe sallayın ve bazı liflerin kolayca ayrılmaya başlayıp başlamadığını kontrol edin. Bu durumda, kollajenazı etkisiz hale getirmek ve çıkarmak için kasları oda sıcaklığında Tyrode ile yıkayın.
    NOT: Yıkama işlemi, pipetlerle kaslara dokunmadan dikkatlice yapılmalıdır. 0.8 mL Tyrode ekleyerek başlayın ve ardından çözeltinin 0.8 mL'sini çıkarın. Bu prosedürü 4-5 kez tekrarlayın ve çözümün tamamen şeffaf hale geldiğini doğrulayın.
  6. Ateşle parlatılmış Pasteur pipet setinin yardımıyla Tyrode'da çok nazik bir öğütme ile kasların büyük kısmından daha fazla lif ayırın. Solüsyonu en geniş pipetle (5 mm uç) kasın etrafında çalkalayarak başlayın ve ardından kasları pipetin 3-4 kez içine ve dışına yavaşça çekin. Kas lifleri serbest bırakmaya başladığında ve inceldiğinde, işlemi bir sonraki pipetle (4 mm uç) tekrarlayın.
    NOT: Bu prosedürle işlenen lifler, Ek Video S2, Ek Video S3, Ek Video S4 ve Ek Video S5'te PL, EDL, EHL ve soleus lifleri kullanılarak örneklendiği gibi, 24 saatten fazla bir süre boyunca uyarılabilir ve hızlı bir şekilde büzülür.

4. Deneysel prosedürler

NOT: İzole edilmiş lifler sarkoplazmik Ca2+ konsantrasyon tahminleri, morfometrik ölçümler ve miyozin ağır zincir (MHC) ekspresyon çalışmaları için kullanılmıştır.

  1. Sarkoplazmik Ca ölçümü2+ seğirme sırasında konsantrasyon
    1. Deneysel banyo odasına temiz, cam bir slayt monte edin. Slaytı 2-3 μL laminin ile kaplayın ve ~400 μL fiber süspansiyonu slaytın üzerine dökmeden önce 30 saniye kurumasını bekleyin. Liflerin oda sıcaklığında 10-15 dakika laminine yapışmasına izin verin.
    2. Deney odasını, epifloresan için donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskobun sahnesine monte edin (Şekil 3A).
    3. Deney odasının her iki tarafına yerleştirilmiş iki platin elektrot boyunca dikdörtgen akım darbeleri (0.8-1.2 ms) uygulayarak liflerin canlılığını doğrulamak için tek seğirmeleri uyandırın. Laminine bağlandığında bile, liflerin büzülmesi esas olarak uç noktalarda hala görülebilir.
    4. Lifleri 3.5-4.5 μM hızlı Ca2+ boya Mag-Fluo-4, ile 4-5 dakika Tyrode çözeltisi içinde yükleyin. Bu sürenin sonunda, hücre dışı boyayı çıkarmak için Tyrode ile hafifçe yıkayın. Hücre içi boyanın karanlık koşullar altında ~ 15-20 dakika boyunca esterden arındırılmasına izin verin. Boya bölümlendirmesini önlemek için sıcaklığı her zaman 22 °C'nin altında tutun.
      NOT: Yükleme Tyrode çözeltisindeki nihai DMSO konsantrasyonu %0,5'ten az olacak şekilde, yalnızca dimetil sülfoksit (DMSO) içinde bir Mag-Fluo-4, stoğu hazırlayın.
    5. Fiberi beyaz ışık yayan diyot (LED) ve uyarma/dikroik/emisyon için aşağıdaki dalga boylarına sahip bir filtre seti ile aydınlatın: 450-490/510/515 nm (Şekil 3A).
      NOT: Alternatif uyarma kaynakları arasında cıva ve ksenon floresan lambalar bulunur. Boyanın foto ağartılmasını ve hücreye zarar vermesini önlemek için uyarma noktasının mümkün olan en düşük yoğunluğunu ve boyutunu kullanın.
    6. 20-22 ° C'de deney odasının her iki tarafına yerleştirilmiş iki platin elektrot aracılığıyla dikdörtgen akım darbeleri (0.8-1.2 ms) uygulayarak fiberin Ca 2+ tepkisini (sarkoplazmik Ca 2+ geçici maddeler) uyandırın.
    7. Floresan için uygun yağa daldırma 40x uzun mesafeli objektif ve bir sayısallaştırıcıya bağlı bir fotoçoğaltıcı tüp (PMT) ile ışık sinyallerini toplayın ve kaydedin (Şekil 3A ve Ek Video S6). Edinme yazılımında 0-200 rastgele birimlik (AU) bir ölçek sağlayın ve uyarma noktasının boyutunu ve PMT'nin kazancını modüle ederek deneyin dinlenme floresansını (Fdinlenme) bu ölçekte 10 AU'ya ayarlayın. Prosedür standartlaştırıldıktan sonra, kazancı bir deneyden diğerine değiştirmeden tutun ve ölçeği yalnızca nokta boyutunda küçük ayarlamalar yaparak ayarlayın.
      NOT: Hareket artefaktları ortaya çıkarsa, Tyrode çözeltisinde 20-30 μM N-benzil-p-toluen sülfonamid (BTS) kullanın.
    8. Sinyalleri aşağıdaki gibi analiz edin ve kalibre edin:
      1. Alçak geçiren tüm izi 1 kHz'de filtreler.
      2. İzin 1 saniyesinde Frestini hesaplayın, Frestini 0'a ayarlayın ve tepe sarkoplazmik Ca2+ geçici genliklerinin genliğini (Ftepe noktası) ölçün. Genliği denklem (1)'deki gibi sunun:
        Equation 1(1)
      3. Denklem (2)26 ve aşağıdaki parametreleri kullanarak tepe Ca2+ konsantrasyonunu ([Ca2+], μM) hesaplayın: in situ ayrışma sabiti (Kd) = 1,65 × 105 μM2, maksimum floresan (Fmaks) 150,9 AU, minimum floresan (Fmin) 0,14 AU, Mag-Fluo-4 konsantrasyonu [D]T 229,1 μM26. Fzirvesi 4.1.8.2 adımında zaten elde edilmiştir.
        Equation 2(2)
      4. Genliğin %10'undan %90'ına (RT, ms) yükselme süresini, maksimumun yarısındaki süreyi (HW, ms) ve genliğin %90'ından %10'una (DT, ms) bozunma süresini ölçün. Ardından, bozunma kinetiğini biüstel fonksiyona uymaya göre tahmin edin (denklem 3):
        Equation 3(3)
      5. Bozunma τ1 ve τ2 (ms) zaman sabitlerinin ve A1 ve A226 genliklerinin değerlerini kaydedin.
  2. Morfometrik ölçümler
    1. Deneysel banyo odasına temiz, cam bir slayt monte edin. Slaytı 2-3 μL laminin ile kaplayın ve ~400 μL fiber süspansiyonu slaytın üzerine dökmeden önce 30 saniye kurumasını bekleyin. Liflerin oda sıcaklığında 10-15 dakika laminine yapışmasına izin verin.
    2. Deney odasının her iki tarafına yerleştirilmiş iki platin elektrot boyunca dikdörtgen akım darbeleri (0.8-1.2 ms) uygulayarak liflerin canlılığını doğrulamak için tek seğirmeleri uyandırın. Laminine bağlandığında bile, liflerin büzülmesi esas olarak uç noktalarda hala görülebilir.
    3. 10x ve 20x objektifler ve ters çevrilmiş bir floresan mikroskobuna monte edilmiş en az 5 megapiksellik bir kamera kullanarak canlı liflerin görüntülerini elde edin. Görüntüleri 'de saklayın. Çevrimdışı analizler için TIFF formatı.
      NOT: Uzun bir fiberi tamamen yakalamak için ~2-6 görüntüden oluşan bir set gerekebilir.
    4. Aynı büyütme altında bir mikroskop mikrometre kalibrasyon cetvelini görüntüleyin. Görüntüleri 'de saklayın. Çevrimdışı analizler için TIFF formatı.
    5. Görüntü analizleri için ücretsiz yazılımın kalibrasyon aracını kullanarak liflerin uzunluklarını ve çaplarını aşağıdaki gibi ölçün:
      1. Ek Şekil S1'de gösterildiği gibi Analiz Et/Ayarla ölçek aracını kullanarak mikroskop mikrometre kalibrasyon cetveli yardımıyla görüntülerdeki pikseller ile bilinen mesafe (μm) arasında bir ilişki kurun.
      2. Ek Şekil S1'de olduğu gibi, lifin bir ucundan diğerine uzunluklarını ve lif boyunca 2-6 farklı yerdeki çapları ölçün (uzunluğuna bağlı olarak görüntü başına 1-2 ölçüm).
      3. Uzunluk değerini (μm veya mm) ve lif başına ölçülen tüm çapların (μm) ortalamasını bildirin.
  3. Miyozin ağır zincir ekspresyon çalışmaları
    NOT: MHC'nin tüm kaslarda immünofloresan43 ve sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE)33,44,45,46 ile belirlenmesiyle ilgili ayrıntılar için lütfen Ek Dosya 1'e bakın. FDB ile izole edilmiş liflerin süspansiyonunda MHC'nin immünofloresan tayini ile lif tiplemesi için protokol aşağıdaki gibidir:
    1. Beş temiz cam slaytın her birini 2-3 μL laminin ile kaplayın ve her bir slaytın üzerine ~300 μL fiber süspansiyon dökmeden önce 30 saniye kurumasını bekleyin. Liflerin oda sıcaklığında 4 saat boyunca laminine yapışmasına izin verin.
    2. Müstahzarları oda sıcaklığında 30 dakika boyunca dondurucuda soğutulmuş asetonla sabitleyin.
    3. PBS ile 3 kez nazikçe yıkayın.
    4. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca% 0.7 Triton X-100 ile desteklenmiş PBS ile hücre zarlarını geçirgenleştirin.
    5. % 0.2 sığır serum albümini (BSA) ve% 0.04 Triton X-100 ile desteklenmiş PBS ile 3 kez nazikçe yıkayın ve ardından% 2 BSA,% 2 keçi serumu ve% 0.4 Triton X-100 ile oda sıcaklığında 30 dakika boyunca PBS ile bloke edin.
    6. % 0.2 BSA ve% 0.04 Triton X-100 ile desteklenmiş PBS ile 3 kez nazikçe yıkayın ve birincil antikorlarla aşağıdaki gibi inkübe edin:
      1. Her bir anti-MHC primer antikorunu PBS'de ayrı bir şişede% 1 BSA ve% 0.04 Triton X-100 ile seyreltin: anti-I (1: 1.500), anti-II (1: 600), anti-IIA (hibridomdan tüm şartlandırılmış ortamı kullanın) ve anti-IIB (1: 500).
      2. Her slaytı bir antikor ile ve kalan slaytı 4 ° C'de 12-16 saat boyunca kontrol olarak PBS ile inkübe edin.
        NOT: Bu protokolde, IIX tipi lifler tüm numunelerde etiketsiz kalmıştır.
    7. PBS ile 3 kez nazikçe yıkayın ve tüm slaytları oda sıcaklığında 1-2 saat boyunca floresan yeşil bir moleküle bağlı ikincil antikor (1:800) ile inkübe edin.
    8. Çekirdekleri 1 μg/mL Hoechst ile 15 dakika boyayın.
    9. PBS ile 3 kez nazikçe yıkayın, dikkatlice 20-40 μL montaj ortamı ekleyin ve bir lamel yerleştirin.
      NOT: Nazik çözelti değişimleri ve yıkama, düzinelerce elyafın slayta bağlı kalmasını sağlayarak deneyi istatistiksel olarak sağlam hale getirir.
    10. Floresan için uygun 10x objektif ve uyarma/dikroik/emisyon için aşağıdaki dalga boylarına sahip bir filtre seti kullanarak her slaydı görselleştirin: 450-490/510/515 nm ve tüm pozitif ve negatif lifleri sayın. Alternatif olarak, aynı teknik koşulları ve ters çevrilmiş bir floresan mikroskobuna monte edilmiş en az 5 megapiksellik bir kamerayı kullanarak floresan görüntüler elde edin ve bunları . Çevrimdışı analizler için TIFF formatı.
    11. Her slaytın pozitif ve negatif liflerini bir veritabanına kaydedin ve ilgili slaytta bulunan toplam lif sayısına göre pozitif I, IIA, IIB ve toplam II liflerinin yüzdelerini hesaplayın. IIA+IIB'nin toplamını toplam II liflerinin yüzdesinden çıkararak IIX liflerinin yüzdesini hesaplayın. I+II'nin toplamını %100'lük bir değerden çıkararak hibrit I/IIA fiberlerin yüzdesini tahmin edin. Son olarak, saf tip I ve II liflere sahip olmak için hibrit hücrelerin yüzdesini I ve II'nin toplamından çıkarın.
      NOT: MHC kompozisyon çalışmalarında, lif tipleri büyük harfle, izoformlar ise küçük harf46 ile gösterilir.
  4. Hematoksilen ve eozin boyama
    1. Temiz, cam bir lamı 2-3 μL laminin ile kaplayın ve ~300 μL fiber süspansiyonu kızak üzerine dökmeden önce 30 saniye kurumasını bekleyin. Liflerin oda sıcaklığında 4 saat boyunca laminine yapışmasına izin verin.
    2. Preparatı Carnoy çözeltisi (% 60 mutlak etanol,% 30 kloroform,% 10 asetik asit) ile oda sıcaklığında 5 dakika sabitleyin.
    3. Hematoksilen ile 90 saniye inkübe edin.
    4. Musluk suyuyla 3 kez nazikçe yıkayın.
    5. % 70 etanol içinde hazırlanan% 1 eozin Y ile 30 saniye inkübe edin.
    6. Musluk suyuyla 3 kez nazikçe yıkayın.
    7. 3x'i mutlak etanole daldırın.
    8. Ksilol içinde 60 saniye inkübe edin.
    9. 20-40 μL montaj ortamı ekleyin ve geleneksel bir mikroskopla görselleştirin. En az 5 megapiksellik bir renkli kamera kullanarak istenen büyütmede görüntüler elde edin.

5. İstatistiksel analizler ve grafik oluşturma

NOT: Deney birimi bir kas lifidir.

  1. Sonuçları ortalama ± standart sapma olarak ifade edin ve bazı analizler için %95 (%CI95) güven aralıklarını hesaplayın.
  2. Gruplar arasında uzunluk, çap ve Ca2+ geçici olayların kinetiğini karşılaştırmak için, Bonferroni'nin düzeltilmesi ile varyans analizi (ANOVA) ve post-hoc testleri yapın.
  3. Sırasıyla Shapiro-Wilk ve Levene'nin testlerini kullanarak normalliği ve varyans eşitliğini değerlendirin.
  4. p < 0.05 olduğunda farkları önemli olarak düşünün.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Sarkoplazmik Ca2+ seğirme sırasında konsantrasyon
Ayrışmış lifler kümesinde fizyolojik deneylerin uygulanabilirliğini göstermek ve uyarma-kasılma eşleşmesi (ECC) ve lif tipleri hakkındaki önceki bulgularımızı genişletmek için, tüm kaslardan liflerde Ca2+ geçişleri elde edildi. İlk olarak, FDB (n = 5) ve EDL (n = 7), morfoloji tip II (MT-II) olarak bilinen Ca2+ kinetik gösterdi. Bunlar, RT'si ~1 ms süren hızlı, dikenli sinyallerdir; bozunma fazı, ilk bileşen (A1) tüm genliğin %30'undan daha büyük olan ve tepe noktası [Ca2+] 15 ile 30 μM 33,47 arasında olan iki üstel bir fonksiyonla donatılabilir. Sonuçları Tablo 1'in ilk sütununda toplanırken (n = 12), soleus'un Ca2+ geçişlerinin (n = 6) sonuçları Tablo 1'in ikinci sütununda sunulur. Soleus'un sinyalleri, morfoloji tip I (MT-I, Şekil 3B) -daha geniş, RT değeri 1.2 ms'nin üzerinde, A1 %30'dan düşük ve tepe noktası [Ca2+] 7 ile 13 μMarasında 33,47 olarak sınıflandırıldı. Bu iki sütun, yeni kasların Ca2+ geçişlerini karşılaştırmak için referans olarak kabul edildi. PDQA (n = 4), PL (n = 6) ve EHL'den (n = 4) gelen tüm fiberler MT-II'yi paylaştığından (Şekil 3B), verileri Tablo 1'in üçüncü sütununda toplanır (n = 14). Bu sinyaller ~1 ms'lik bir ortalama RT, ~%45'lik bir A1, 15 μM'nin üzerinde bir tepe noktası [Ca2 +] gösterdi ve ilk sütunda sunulan sonuçlarla çok iyi karşılaştırıldı, ancak istatistiksel analiz tarafından onaylandığı gibi ikinci sütunda gösterilenlerden açıkça farklıdır (Tablo 1). Tüm numunenin en hızlı sinyali, ΔF/F 0.66, [Ca2+] 16.99 μM, RT 0.85 ms, HW 2.42 ms ve DT 10.56 ms olan bir EHL fiberinden geldi. τ1 ve τ2 sırasıyla 1.63 ve 7.21 ms iken, A1 ve A2 değerleri %56.60 ve %43.40 idi. En yavaş sinyal, ΔF/F 0.41, [Ca2+] 9.76 μM, RT 1.56 ms, HW 9.43 ms ve DT 31.88 ms olan bir soleus fiberden geldi. τ1 ve τ2 sırasıyla 2.81 ve 96.42 ms iken, A1 ve A2 değerleri %19.55 ve %80.45 idi. 

Kısa, orta ve uzun liflerden oluşan bir pil
Lifler arasında kas kaynaklarına göre belirgin farklılıkların gözlemlenmesi, daha eksiksiz bir morfometrik karakterizasyon sağladı. Şekil 4'ün histogramları, tüm kaslardaki liflerin uzunluklarında çarpıcı farklılıklar göstermektedir. Bu, FDB'den (227.06 μm) en kısa elyaf ile soleus'tan (5.69 mm) en uzun elyaf karşılaştırıldığında vurgulanır. Ortalama uzunluk değerleri Tablo 2'de özetlenmiştir. Gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı fark vardı (p < 0.01). Bu sonuçlar, FDB liflerinin kısa (<1 mm) olarak sınıflandırılmasına izin verir; Ara madde olarak PDQA ve PL (1 ila 3 mm); ve EDL, EHL ve soleus uzunluğunda (>3 mm) (Ek Şekil S2).

Tersine, tüm kasların liflerinin ortalama çaplarında (Tablo 2) ve değerlerin dağılımında (Şekil 4) küçük farklılıklar gözlenmiştir. Yine de gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar vardı (p < 0.01). Ayrıntılı olarak değerlendirildiğinde, FDB ile birbirleri arasında ve FDB (FDB 38.40 ± 9.40 μm, n=370) ile orta ve uzun lif havuzu (45.07 ± 9.99 μm, n=422, p < 0.05) arasında farklılıklar vardı. Tüm numunenin en ince hücresi 18.42 μm (FDB) ölçüldü ve en kalın hücre 82.79 μm'ye (PDQA) ulaştı.

Fizyolojik deneylerde kullanılan lif türleri
İlk olarak, her bir kasta bulunan lif tipleri immünofloresan ile belirlendi. Soleus hariç, kaslar tip II liflerin% 76'sından fazlasının baskınlığını gösterdi (Ek Şekil S3, Tablo 3 ve Tablo 4). EHL, PL ve PDQA, PDQA'da bulunduğu gibi, hızlı liflerin %90'ından fazlası ve tip IIB liflerinin %58,8'ine kadar olan özellikle hızlı kaslardır. EHL ve PDQA neredeyse tip I liflerden yoksundu. Hibrid I/IIA lifleri tüm kaslarda düşük yüzdelerde mevcuttu. Beklendiği gibi, tip I ve IIA lifleri, soleusun toplam liflerinin% 82'sinden fazlasını oluşturuyordu. Bu kas neredeyse en hızlı IIB liflerinden yoksundur. Lif tiplerinin profiline göre, analiz edilen altı kas arasında soleus en yavaş olanıdır ve PDQA en hızlı kastır.

Daha sonra ve tek lifli fizyolojik deneyler için daha uygun olduğu için, ayrışmış FDB'den türetilen hücre süspansiyonunda hangi tür liflerin ortaya çıktığı sorusu ele alındı. Hücre süspansiyonundaki liflerin profilinin, kriyoseksiyonlarda bulunan liflerin bileşimini yansıttığı bulunmuştur: ayrışmış dört liften üçü tip II idi (Şekil 5 ve Tablo 3).

Son olarak, kasların bileşimi, MHC izoformlarının SDS-PAGE ile ayrılmasıyla doğrulandı. Sonuçlar, immünofloresan testlerinde gözlenen genel paternle tutarlıydı. Soleus, MHC IIa ve I'de zenginleştirilirken, EDL, EHL ve peronei, MHC IIx ve IIb'de zenginleştirildi, ancak I'den yoksundu (Ek Şekil S4).

Figure 1
Şekil 1: Çalışmanın tasarımı. (A) Diseksiyon prosedürüne başlamadan önce kurulacak ekipman ve çözümler. 1. Bir numaralı stereoskop. 2. Aşağıdan yukarıya: portatif bir soğutucu (sarı kasa) içinde beş adet ateşle parlatılmış pipet, diseksiyon aleti ve kollajenaz şişesi seti. 3. Filtre kutusu, diseksiyon odası, kapaklı etiketli cam şişeler, filtrelenmiş çözeltili raf. 4. Diseksiyon araçları. 5. Bir kamera ve bir elektrik stimülatörüne bağlı iki numaralı diseksiyon odası ile stereoskop. (B) Şekil 2'de daha ayrıntılı olarak açıklandığı gibi farelerin altı arka bacak kası setinin diseksiyon prosedürü. (C) Diseksiyondan sonra, bir sonraki protokol adımına geçmeden önce kas kasılması ve bütünlüğü doğrulanmalıdır. Sol paneldeki sol kas, ayrışmış lifler elde etmek için kullanılmaması gereken dalgalı, hiperkontrakte edilmiş, tepkisiz bir PL kası (mavi ok) gösterir. Bunun yerine, diseksiyon protokolünün optimize edilmesi ve yeniden başlatılması gerekir. İyi diseke edilmiş PL muadili (sol paneldeki sağ kas) uzun bir görünüm gösterir ve gözle görülür şekilde kasılır (Ek Video S1). Sağdaki panel, kollajenaz çözeltisi içinde doğru, düz görünüme sahip iki EDL (mavi ok) ve iki FDB kasını gösterir. (D) Kaslar ayrıldıktan sonra, izole edilmiş lifleri deney odasına dökün ve kasılmalarını ve bütünlüklerini kontrol edin. Sol panelde, canlı (mavi ok) ve ölü PL fiberleri. Sağ panelde, canlı (mavi ok) ve ölü EDL fiberleri. (EG) İzole edilmiş liflerle üç set deney yapıldı: (E) Bir seğirme sırasında Sarkoplazmik Ca2+ konsantrasyon ölçümleri (Şekil 3'teki sonuçlar). (F) Morfometrik analizler (sonuçlar Şekil 4'te sunulmuştur). Bu örnek bir PL fiberi göstermektedir. (G) Miyozin ağır zincir ekspresyonu çalışmaları için immünofloresan (sonuçlar Şekil 5'te gösterilmiştir). Bu örnek, izole edilmiş bir FDB fiberini göstermektedir. Ölçek çubukları = 5 mm (B,C), 100 μm (D,F,G). Kısaltmalar: FDB = fleksör digitorum brevis; PL = peroneus longus; EDL = ekstansör digitorum longus. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Farenin altı arka bacak kası setini incelemek için anatomik referanslar ve genel prosedür. Sıralar, yukarıdan aşağıya, kasları en iyi diseksiyon sırasına göre sunar: FDB, soleus, EDL, EHL, PL ve PDQA. Sütunlar, soldan sağa, diseksiyon sırasında kilometre taşlarını sunar. İlk sütun, diseksiyonun başlayabilmesi için açıkta kalan kasları veya distal tendonlarını gösterir. Örneğin, mavi oklar FDB'yi ve soleus in situ ve EDL'nin distal tendonlarını gösterir. Aşağıdaki iki sütun, diseksiyonun kendisini ve distal tendon(lar) kesildikten sonra açığa çıkan kasları, örneğin EDL satırındaki mavi okla etiketlendiği gibi göstermektedir. FDB'nin beşinci basamağa yönlendirilen dalının kaldırılması önerilir. En sağdaki sütun, proksimal tendonlar görüntülerin üst kısmına yönlendirilmiş olarak tamamen çıkarıldıktan sonra kasları sunar. Mavi, süreksiz çizgiler (en sağ sütun), kollajenazın kütlelerine girmesini sağlamak için soleus ve EDL kaslarında yapılması gereken uzunlamasına veya çapraz kesimleri gösterir. Ölçek çubukları = 5 mm. Kısaltmalar: FDB = fleksör digitorum brevis; PL = peroneus longus; EDL = ekstansör digitorum longus; EHL = ekstansör hallüsis longus; PDQA = peroneus digiti quarti. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Farenin altı arka bacak kasından elde edilen liflerde kaydedilen Ca2+ geçici akımları. (A) Loş aydınlatma altında Ca2+ geçici akımlarının alınması için kullanılan kurulum. Sol panel: 1. Ters çevrilmiş bir floresan mikroskobuna (2) bağlı PMT. 3. Mikroskoba bağlı kamera. 4. Deney odasına bağlı elektrik stimülatörü. 5. Mikromanipülasyon sistemi, elektrofizyoloji ve enjeksiyon tahlillerininCa2+ geçici akım edinimini tamamlaması planlandığında kullanılabilir. Orta panel: Yüklü hücrelerin bulunduğu deney odası (insert) mikroskobun tablasına monte edilir ve boyayı uyarmak için mavi ışıkla (450-490 nm, mavi ok) aydınlatılır. Bu kurulumda, 1'den 5'e kadar olan öğeler bir titreşim önleyici masanın üzerine ve bir Faraday kafesinin içine yerleştirilir. Sağ panel: Büzülme ve boya yükleme kalitesi kamera (6) ile doğrulandıktan sonra, yayılan ışık PMT'ye yönlendirilir, elektriksel stimülasyon başlar ve sinyal, Ca2+ geçişini kaydetmek için sayısallaştırıcıya (7) ve toplama yazılımına (8) beslenir. Canlı bir deney sırasında bu öğelerin entegre işlevi Ek Video S6'da görülebilir. (B) Temsili, kalibre edilmiş Ca2+ FDB, PDQA, PL, EDL, EHL ve farenin soleus liflerinin geçişleri. FDB, PDQA, PL, EDL ve EHL'nin benzer, hızlı, dar sinyalleri, bu kaslarda en bol bulunan IIX ve IIB liflerinden türediği bilinen MT-II'ye sahip olduklarını doğrulamaktadır. Buna karşılık, soleus geçici daha yavaş ve daha küçüktür, orijinal olarak I ve IIA liflerinde tanımlanan MT-I'e özgüdür. EDL ve soleus sinyalleri üzerindeki kırmızı eğri, MT-I ve MT-II'nin bozunma fazının iki üstel bozunma fonksiyonu ile donatılabileceğini göstermektedir. Kalibrasyon çubukları tüm paneller için geçerlidir. Dikey çubuk = 2,5 μM [Ca2+], yatay çubuk = 10 ms. Alttaki renk tuşu kasları tanımlamaya yardımcı olur. Kısaltmalar: FDB = fleksör digitorum brevis; PDQA = peroneus digiti quarti; PL = peroneus longus; EDL = ekstansör digitorum longus; EHL = ekstansör hallüsis longus; PMT = fotoçoğaltıcı tüp; MT-I = morfoloji tip I; MT-II = morfoloji tip II. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Farenin altı arka bacak kası setinin enzimatik ayrışmasıyla elde edilen kısa, orta ve uzun liflerin morfometrik ölçümleri. Her kastan elde edilen sağlam, sağlıklı, temsili lifler en soldaki sütun panellerinde gösterilmiştir. Görüntüler, kas liflerinin doğrudan manipüle edilmemesi ile yalnızca arka plan gürültüsünü azaltmak ve kontrastı artırmak için düzenlendi. Ölçek çubukları = 100 μm (tüm paneller). Ölçüm protokolünün yanı sıra tüm uzun liflerin görünümü ve kalitesi, Ek Şekil S1'de daha ayrıntılı olarak görüntülenebilir. Orta sütun, en kısa lifleri oluşturan kastan (FDB) en uzun liflere sahip olana (soleus) doğru sıralanan uzunluk dağılımlarını gösterir. Uzunlukların sürekliliği vardır, böylece kaslar arasında toplam ~5.5 mm'ye yayılan bir miktar örtüşme vardır. Çap dağılımları en sağdaki kolon panellerinde sunulmuştur. Çoğu lif 30 ila 60 μm arasındadır ve kaslar arasında küçük farklılıklar vardır. Morfometrik ölçümlerin test-tekrar test analizleri (n = 78 lif, n = 792 tüm örneklemin %9.85'ine eşdeğer) çok yüksek tekrarlanabilirlik gösterdi (ortalama varyasyon katsayısı %1.77 ─güven aralığı %95, CI95%, %1.26-2.27 ─ ortalama korelasyon katsayısı 0.99 (CI95% 0.98-0.99)), sonuçların iyi güvenilirliğini vurguladı. Gauss dağılım eğrileri grafik lisanslı yazılımlarla eklenmiştir. Ek Şekil S2 , daha kolay karşılaştırma için uzunluk ve çapın ortalama değerlerinin çubuk grafiklerini ve tüm kasların uzunluk ve çap dağılımlarının birleşmelerini göstermektedir. Alt kısımdaki renk tuşu, kasları tanımlamaya yardımcı olur. Kısaltmalar: FDB = fleksör digitorum brevis; PDQA = peroneus digiti quarti; PL = peroneus longus; EDL = ekstansör digitorum longus; EHL, = ekstansör hallusis longus. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Ayrışmış FDB kaslarında hücre süspansiyonundaki lif tipleri için immünofloresan deneyleri. Farklı alanların görüntüleri, slaytların altına yapışmış sağlam, ayrışmış FDB liflerini gösterir. (A) Bir antimiyozin II-pozitif lif (yeşil floresan, diyagonal açık mavi ok), negatif olanla (açık mavi ok ucu) açıkça kontrast oluşturur ve testin ayırt etme gücünü gösterir. Görüntüdeki her iki lifin varlığı, çekirdeklerin etiketlenmesi (mavi floresan) nedeniyle doğrulanabilir. (B) Farklı bir alan, başka bir antimiyozin II-pozitif lif gösterir. (C) Antikorlar tarafından A bantlarındaki (yeşil floresan) miyozin ağır zincirinin doğru tanımlanması konfokal mikroskopi kullanılarak doğrulandı. En kötü şöhretli enine siyah çizgiler, aktin bakımından zenginleştirilmiş I bantlarına karşılık gelir ve bu nedenle antikorlar tarafından tanınmaması beklenir. (D) Hematoksilen tipik periferik, bol çekirdekleri mor renkte etiketler ve eozin, lifin sarkoplazmasını etiketleyerek bozulmamış, olgun bir hücreyi gösterir. Ölçek çubukları = 50 μm (A,B,D); 10 μm (C). Kısaltma: FDB = fleksör digitorum brevis. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Lif FDB ve EDL Soleus (Soleus Türkçesi PDQA, PL ve EHL p
n 12 6 14
ΔF/F 0,68±0,15 0,46±0,06*,† 0,66±0,12 <0,01
[Ca2+] (μM) 17.46±5.18 11.14±1.86*,† 16.82±3.29 <0,01
RT (ms) 0,95±0,10 1,26±0,20*,† 0,95±0,09 <0,01
Yükselme eğimi (F/ms) 5,97±1,41 3,12±0,79*,† 5,83±0,97 <0,01
Donanım (ms) 3,59±0,85 8.17±3.00*,† 3.19±0.54 <0,01
DT (ms) 16.98±7.37 27.26±7.13*,† 11.32±2.06* <0,01
Bozunma eğimi (F/ms) -0,24±0,07 -0,10±0,03*,† -0,35±0,08* <0,01
τ1 (ms) 1,86±0,37 2,07±0,66† 1.57±0.18 <0,05
τ2 (ms) 11.50±3.93 46.38±27.14*,† 8.29±2.14 <0,01
A:1 (%) 48.14±7.27 25,94±8,98*,† 44.59±8.29 <0,01
A:2 (%) 51,86±7,27 74,06±8,98*,† 55.41±8.29 <0,01
Morfoloji MT-II MT-I MT-II

Tablo 1: Farenin altı arka bacak kasından elde edilen enzimatik olarak ayrışmış liflerdeki Ca2+ geçici olayların kinetiği. Değerler ortalama ± standart sapmadır. p değerleri varyans analizi testine karşılık gelir. *FDB ve EDL gruplarından önemli ölçüde farklıdır. †PDQA, PL ve EHL gruplarından önemli ölçüde farklıdır. Kısaltmalar: F = floresan; [Ca2+] = sitozolik pikCa2+ konsantrasyonu; RT = yükselme süresi; HW = maksimum yarı süre; DT = bozunma süresi; τ1 ve τ2 = bozunmanın zaman sabitleri; A1 ve A2 = bozunma genlikleri; FDB = fleksör digitorum brevis; PDQA = peroneus digiti quarti; PL = peroneus longus; EDL = ekstansör digitorum longus; EHL = ekstansör hallüsis longus; MT-I = morfoloji tip I; MT-II = morfoloji tip II.

Lif FDB (Tanıtım Bülteni KVKK PL EDL (EDL) EHL (İngilizce) Soleus (Soleus Türkçesi p
n 370 142 80 70 87 43
Uzunluk (mm) 0,42±0,05* 2,20±0,26** 2.69±0.26† 3.51±0.53†† 3.83±0.44‡ 4,62±0,64 <0,01
Çap (μm) 38.40±9.40* 46.39±9.50 45.98±11.18 44.43±7.62 41.96±9.16 46.36±12.85 <0,01

Tablo 2: Farenin altı arka bacak kası setinin enzimatik ayrışmasıyla elde edilen kısa, orta ve uzun liflerin morfometrik ölçümleri. Değerler ortalama ± standart sapmadır. p değerleri varyans analizi testine karşılık gelir. *PDQA, PL, EDL, EHL ve soleus'tan istatistiksel olarak farklıdır. **PL, EDL, EHL ve soleus'tan önemli ölçüde farklıdır. †EDL, EHL ve soleus'tan önemli ölçüde farklıdır. ††EHL ve soleus'tan önemli ölçüde farklıdır. ‡Soleus'tan önemli ölçüde farklı. EHL'den önemli ölçüde farklı. Kısaltmalar: FDB = fleksör digitorum brevis; PDQA = peroneus digiti quarti; PL = peroneus longus; EDL = ekstansör digitorum longus; EHL = ekstansör hallusis longus.

Kas/Lifler N n Toplam tip I + I/IIA (%) Toplam tip II (%)
FDB (Tanıtım Bülteni 5 747 21.94±11.47 78.06±11.47
*FDB 8 1483 23.46±2.51 76.54±2.51

Tablo 3: Farenin ayrışmış FDB kaslarında kriyoseksiyonlarda ve hücre süspansiyonunda lif tipleri. Değerler ortalama ± standart sapmadır. N, hayvan sayısını, n ise deneylerde analiz edilen toplam lif sayısını ifade eder. FDB sırası, kriyoseksiyonlarda belirlendiği gibi tüm kasın verilerini sunarken, *FDB sırası, kasın ayrışmasından sonra hücre süspansiyonundaki izole liflere karşılık gelir. "Toplam tip II" sütunu, saf lifler tip IIA, IIX ve IIB'yi yansıtır. Kısaltma: FDB = fleksör digitorum brevis.

Kas N n Tip I (%) Tip I/IIA (%) Tip IIA (%) Tip IIX (%) Tip IIB (%) Toplam tip II (%)
KVKK 4 597 0.00±0.00 10.15±2.62 19.33±6.19 11.68±7.57 58,84±7,63 89,85±2,62
PL 4 576 3.44±3.94 2.04±2.48 23.01±7.03 35,85±5,66 35,66±9,36 94.52±3.90
EDL (EDL) 4 826 0.00±0.00 10.44±8.33 5.67±5.07 24.75±10.93 59.15±11.36 89,56±8,33
EHL (İngilizce) 5 618 0,24±0,76 5.29±3.31 19.04±6.83 21.18±10.91 54,25±11,73 94.47±3.05
Soleus (Soleus Türkçesi 4 729 32.18±4.48 1.74±1.30 50.37±7.46 14.58±6.94 1.12±1.93 66.08±5.59

Tablo 4: Farenin orta ve uzun liflerini veren kasların kriyoseksiyonlarındaki lif tipleri. Değerler ortalama ± standart sapmadır. N, hayvan sayısını, n ise deneylerde analiz edilen toplam lif sayısını ifade eder. Tüm sıralar, kriyoseksiyonlarda belirlendiği gibi tüm kasın verilerini sunar. Tip I, IIA, IIX ve IIB kolonları saf elyafları yansıtırken, I/IIA kolonları hibrit elyafları ifade eder. "Toplam tip II" sütunu, tip IIA, IIX ve IIB sütunlarının toplamıdır. Kısaltmalar: PDQA = peroneus digiti quarti; PL = peroneus longus; EDL = ekstansör digitorum longus; EHL = ekstansör hallusis longus.

Ek Dosya 1: Tüm kaslarda miyozin ağır zincir ekspresyon çalışmaları. Protokoller, kriyoseksiyonlarda immünofloresan ve tüm kasların homojenatlarında sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi ile miyozin ağır zincir izoformlarının belirlenmesi için ayrıntılar sunar. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S1: Farenin altı arka bacak kası setinin enzimatik ayrışması ile elde edilen liflerin morfolojisinin ayrıntıları. (A) Görüntü analiz yazılımında ölçeği ayarlamak için açık olan mikroskop mikrometre kalibrasyon cetveli solda gösterilmiştir. Sağ panel, fiberin uzun eksenine dik mavi çizgilerle (mavi oklar) gösterildiği gibi çapın tekrar tekrar nasıl ölçüldüğünü gösterirken, uzunluk, fiberin ana ekseni boyunca mavi çizgi ile gösterildiği gibi uçtan uca bir kez ölçülmüştür. (B) PDQA, PL, EDL, EHL ve soleus liflerinin (küçük mavi, yeşil, sarı, turuncu ve pembe ekler) uzun ve sağlıklı görünümünü göstermek için küçük düzenlemelerle birkaç görüntü birleştirildi. Birleştirilen görüntüler, liflere daha iyi bir görünüm kazandırmak için daha da düzenlendi (büyük, siyah ve beyaz görüntüler). (C) FDB, PDQA, PL ve soleus liflerinin uçlarının normal düzensizliğini ve iyi bilinen enine çizgilerini vurgulayan DIC görüntüleri. Kalan EDL ve EHL liflerinin DIC görünümü Ek Video S3 ve Ek Video S4'te görülebilir. Ölçek çubukları = 100 μm. Alttaki renk tuşu kasları tanımlamaya yardımcı olur. Kısaltmalar: FDB, fleksör digitorum brevis; PDQA, peroneus digiti quarti; PL, peroneus longus; EDL, ekstansör digitorum longus; EHL, ekstansör hallusis longus; DIC = Diferansiyel girişim kontrastı. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S2: Farenin altı arka bacak kası setinin enzimatik ayrışmasıyla elde edilen liflerin çubuk grafikleri ve birleştirilmiş uzunluk ve çap dağılımları. (A) Çubuk grafikleri (ortalama ± standart sapmaları) ve (B) birleştirilmiş histogramlar, uzunlukların eşitsizliğini, ancak tüm gruplar arasındaki çapların benzerliğini doğrular. *PDQA, PL, EDL, EHL ve soleus'tan önemli ölçüde farklıdır. **PL, EDL, EHL ve soleus'tan önemli ölçüde farklıdır. †EDL, EHL ve soleus'tan önemli ölçüde farklıdır. ††EHL ve soleus'tan önemli ölçüde farklıdır. ‡Soleus'tan önemli ölçüde farklı. EHL'den önemli ölçüde farklı. Alttaki renk tuşu kasları tanımlamaya yardımcı olur. Kısaltmalar: FDB = fleksör digitorum brevis; PDQA = peroneus digiti quarti; PL = peroneus longus; EDL = ekstansör digitorum longus; EHL = ekstansör hallusis longus. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S3: Farenin altı arka bacak kası setinin lif tipi bileşimi için immünofloresan çalışmaları. Analizler için kullanılan temsili antikor etiketli kriyoseksiyonlar, numunelerin iyi kalitesini ve sağlamlığını gösterir. Lif tip I miktarının büyük olduğu soleus hariç, tüm kaslarda lif tip II'nin açık bir baskınlığı vardır. Ölçek çubukları = 100 μm. Alttaki renk tuşu kasları tanımlamaya yardımcı olur. Kısaltmalar: FDB = fleksör digitorum brevis; PDQA = peroneus digiti quarti; PL = peroneus longus; EDL = ekstansör digitorum longus; EHL = ekstansör hallusis longus. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S4: Farenin altı arka bacak kası setinde MHC izoformlarının elektroforetik olarak ayrılması. (A) Farklı günlerde farklı numunelerle çalıştırılan iki temsili tam jel, Coomassie mavisi ile boyandığında MHC izoformlarının ayrılma ve migrasyon mesafesinin kalitesini, temizliğini ve tekrarlanabilirliğini gösterir. Bu iki görüntü, okuyucu için kontrast ve netliği artırmak için hafifçe düzenlenmiş olsa da, analizler düzenlenmemiş jellerde gerçekleştirildi. (B) Altı kasın her biri için bantların analizlerine örnekler. Jelin şeritlerinde bir ROI seçildikten sonra, bir çizim profili oluşturulur ve altı kas setindeki MHC izoformlarının oranını tahmin etmek için bir Gauss uyumu kullanılır. Bulunan MHC bileşimi: FDB: I 9.0 ± %5.0, IIa + IIx 91.0 ± %5.0 (n = 3); PDQA: IIa + IIx %25.9 ± %2.4, IIb %74.1 ± %2.4 (n=3); PL: IIa + IIx %24.9 ± %2.2, IIb %75.1 ± %2.2 (n=3); EDL: IIa + IIx %22.0 ± %2.3, IIb 78.0 ± %2.3 (n = 4); EHL: IIa + IIx %27.5 ± %1.0, IIb %72.5 ± %1.0 (n = 3); soleus: I 35.8 ± %2.5, IIa (varsa +IIx + IIb) %64.2 ± %2.5 (n=4). Alttaki renk tuşu kasları tanımlamaya yardımcı olur. A'daki en sağdaki jelin altındaki gri dikdörtgen, IIa'nın ~ 200 KDa'ya göçünü gösteren moleküler ağırlık işaretleyicisini ifade eder. Kısaltmalar: FDB = fleksör digitorum brevis; PDQA = peroneus digiti quarti; PL = peroneus longus; EDL = ekstansör digitorum longus; EHL = ekstansör hallüsis longus; MHC = miyozin ağır zinciri; ROI = ilgilenilen bölge. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video S1: Hasarlı, dalgalı, peroneus longus (PL, solda) stimülasyon üzerine büzülmezken, sağlam PL (sağda) elektrotlardan daha uzakta olsa bile iyi kasılır. 0,8x büyütme. Stimülasyon protokolü, iki elektrot aracılığıyla 1,2 ms, 0,7 Hz ve 50 V'luk dikdörtgen akım darbeleri serbest bırakır. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video S2: Peroneus longus lifinin sözleşmelenmesi. 20x büyütme. Diferansiyel girişim kontrast modu. Stimülasyon protokolü, iki platin elektrot aracılığıyla 1,2 ms, 0,5 Hz ve 50 V'luk dikdörtgen akım darbeleri serbest bırakır. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video S3: Ekstansör digitorum longus lifinin kasılması. 20x büyütme. Diferansiyel girişim kontrast modu. Stimülasyon protokolü, iki platin elektrot aracılığıyla 1,2 ms, 0,5 Hz ve 50 V'luk dikdörtgen akım darbeleri serbest bırakır. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video S4: Ekstansör hallusis longus lifinin kasılması. 20x büyütme. Diferansiyel girişim kontrast modu. Stimülasyon protokolü, iki platin elektrot aracılığıyla 1,2 ms, 0,5 Hz ve 50 V'luk dikdörtgen akım darbeleri serbest bırakır. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video S5. Soleus lifi sözleşmesi. 20x büyütme. Diferansiyel girişim kontrast modu. Stimülasyon protokolü, iki platin elektrot aracılığıyla 1,2 ms, 0,5 Hz ve 50 V'luk dikdörtgen akım darbeleri serbest bırakır. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video S6: Adım2'te açıklandığı gibi Mag-Fluo-4, ile yüklü bir ekstansör digitorum longus fiberinden bir Ca 4.1.4+ geçici akımının canlı kaydı. Stimülasyon protokolü, iki platin elektrot aracılığıyla 1,2 ms, 0,5 Hz ve 50 V'luk dikdörtgen akım darbeleri serbest bırakır. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Olgun iskelet kası biyolojisini incelemek için mevcut modelleri tamamlamak için, burada kısa, orta ve uzun liflere sahip bir dizi fare kasının başarılı bir şekilde enzimatik ayrışmasını gösteriyoruz. Bu lifler, iskelet kasındakiCa2+ geçici akımlarının MT-II kinetiğinin genelleştirilebilirliğinin gösterilmesine izin verir. Ayrıca, sağlam, bütün kaslardaki lif tipleri sınıflandırıldı. FDB'nin fizyolojik deneyler için en çok kullanılan kas olduğu göz önüne alındığında, ayrışmadan sonra hücre süspansiyonunda bulunan lif türleri değerlendirildi.

Kas biyolojisi çalışmaları için kısa, orta ve uzun bozulmamış liflerden oluşan bir pil
Diseksiyon tekniği, enzimatik tedavinin süresi, kullanılan enzim tipi ve tritürasyon prosedürü, bozulmamış enzimatik olarak ayrışmış lifler elde etmek için protokol içindeki kritik adımlardır. Gereksiz esnemeden kaçınırken hipoksi altındaki süreyi azaltmak için diseksiyon mümkün olduğunca hızlı yapılmalıdır. İkinci nokta, özellikle gastroknemius-soleus kompleksinin yukarı çekilmesiyle çıkarılmaması gereken soleus için geçerlidir. Ayrıca, kapsamlı bir enzimatik işlem (~3 saat)20,48 ve zayıf öğütme prosedürleri (örneğin, araştırmacının sert, düşük deneyimi), çeşitli laboratuvarlarda ampirik olarak onaylandığı gibi hücrelere zarar verir. Kollajenaz tip 2, diğer kollajenaz tiplerine göre tavsiye edilir. Öğütme sırasında kabarcık oluşumundan kaçınılmalı ve kaslar veya lifler plastik pipet uçları yerine sadece cam pipetlerle manipüle edilmelidir. Cam şişelerin kullanımı, tüm prosedür boyunca plastik, konik şişelere göre tercih edilir, çünkü ilki daha fazla görünürlük sağlar, çözeltilerde kasın üstten görünüşlü bir gözlemi için stereoskop üzerine yukarı doğru yerleştirilebilir, kasların gerilmesi için daha fazla alan sağlar FDB'den daha uzun ve daha hacimlidir ve cam Pasteur pipetlerinin neden olduğu çizilmelere karşı dayanıklıdır. Yaş, kilo ve metabolik durum (örneğin, sağlıklı ve yüksek yağlı obezite) yöntemin etkinliğini etkilediğinden, bu makalede kullanılan aralığın dışındaki hayvanlarla çalışırken birkaç parametrenin optimizasyona ihtiyacı olabilir. Daha da önemlisi, bir kasın burada kullanılanlar gibi belirli enzimlere hafif bir şekilde maruz kalması ve doğru bir ayrışma prosedürü, bazıları birkaç yıl önce özetlenen birden fazla grup tarafından on yıllar boyunca toplanan kanıtların gösterdiği gibi, lifleri işlevsel olarak etkilemez49. Bu, manuel olarak disseke edilmiş demetlerde ve enzimatik olarak ayrışmış fare liflerinde elde edilen bir seğirme sırasında hızlı Ca2+ boyalarla ölçülen pik [Ca2 +] 'nın karşılaştırılabilir olarak kabul edilebileceği gerçeğiyle daha da desteklenmektedir (47'de gözden geçirilmiştir).

Kas biyolojisi çalışmaları için C2C12 miyotüpleri, normal ve mutasyona uğramış insan miyoblast hücre hatları veya pluripotent kök hücre (iPSC) türevi lifler 31,39,50,51,52,53 gibi başka modeller olmasına rağmen, bunlar olgunlaşmamıştır ve burada tartışılmamıştır. Geçirgen veya kabuklu lifler de bilgilendirici, iyi karakterize edilmiş modellerdir54,55, ancak sağlam değildirler. Manuel olarak izole edilmiş liflerin modeli, başka bir yerde sunulduğu gibi çeşitli avantajlar sunar20, ancak düşük verimliliğe sahiptir ve yüksek eğitim gerektirir. Bu gerçekler, burada ilgilenilen modelin - enzimatik ayrışma yoluyla elde edilen lifler - farklı tiplerde sağlam, bol, olgun iskelet kası lifleri elde etme imkanı sunduğunu vurgulamaktadır. Bununla birlikte, modelin bir sınırlaması, tendon eksikliğinin, izole edilmiş liflerdeki kasılma özelliklerinin doğrudan değerlendirilmesini sınırlamasıdır.

Liflerin uzunluğunun kasların uzunluğu14,42 ile aynı olmadığı ve liflerin deney birimi olduğu göz önüne alındığında, kasların değil, liflerin uzunluğunu sınıflandırmak daha önemlidir. Sonuçlarımız ve potansiyel deneysel etkileri göz önüne alındığında, FDB lifleri kısa (<1 mm) olarak sınıflandırılabilir; Ara madde olarak PDQA ve PL (1 ila 3 mm); ve EDL, EHL ve soleus uzunluğunda (>3 mm). Kısa lifler en kolay ve en bol miktarda elde edilenlerdir (fare başına ~ 400-500 lif) ve lifin alt bölmeye bağlanmasının anahtar olduğu veya hareket artefaktlarından kaçınılması gereken floresan mikroskobu deneyleri için uygundur (örneğin, Ca2+ geçişler). Uzun lifler, elde edilmesi en zor olanlardır, en düşük işlemeye sahiptir ve ayırma teknikleri veya tek hücreli moleküler biyoloji çalışmaları kullanılarak protein ekspresyonu için daha iyidir. Ara lifler, orta düzeyde eğitimden sonra iyi bir miktarda (fare başına ~ 50 lif) elde edilebilir ve örneğin Ca2+ geçici deneylerinde gösterildiği gibi birçok deneysel yaklaşım için uygundur. FDB, EDL ve soleus'un daha önce kullanıldığını kabul ederek, bu, lifleri PDQA, PL ve EHL kaslarından başarılı bir şekilde izole eden ve böylece olgun iskelet kası çalışmaları için modellerin kullanılabilirliğini artıran ilk çalışmadır. Ayrıca, farklı kaslardan liflerin elde edilmesi, aynı hayvandan daha fazla bilgi elde edilmesini sağlamakta, deneysel değişkenliği azaltmakta, sonuçların istatistiksel gücünü ve biyolojik sağlamlığını artırmakta ve deneylerde kullanılan hayvan sayısını azaltmaktadır.

Ca2+ geçici olayların kinetiğinin genellenebilirliği
Memeli olgun iskelet kası liflerindeki Ca2+ geçici akımlarının kinetiğini analiz ederken, daha önce tip I ve IIA liflerinin morfoloji tip I (MT-I) olarak adlandırılan, IIX ve IIB liflerinin ise MT-II morfolojisini paylaştığını göstermiştik. Tipik olarak, MT-II sinyallerinin RT'si 1.2 ms'den az, DT'si 25 ms'den az, A1 %30'dan yüksek, [Ca2+] 15 μM'nin üzerindedir ve FDB ve EDL fiberlerindekolayca bulunur 33,47. PDQA, PL ve EHL'nin yeni Ca2+ geçişlerinin sonuçlarını burada bulunanlarla ve daha önce FDB ve EDL için yayınlananlarla karşılaştırdıktan sonra, hepsinin de MT-II olduğu sonucuna varmak kolaydır. Bir başka ilginç gözlem de, ayrışmış lifler elde etmek için model olarak tip IIX ve IIB lifleriyle zenginleştirilmiş yeni kasların mevcudiyetinin arttırılmasının, Ca2+ geçici akımlarının kinetiğinin genelleştirilmiş tip IIX ve IIB liflerinin kaynağı ne olursa olsun MT-II'ye sahip olabileceğini doğrulamaya izin vermesidir (yani, fleksörler (FDB), ekstansörler (EDL ve EHL), veya peronei (PDQA ve PL)). Bu, aynı tipteki tüm liflerde oldukça benzer olan yerleşik bir gen hücresel programı veya ECC mekanizmasının profili fikrini güçlendirir ve Ca2+ geçici akımlarının oluşumunun altında yatan moleküler mekanizmadaki (yani izoformlar ve protein miktarı) farklılıkların, lifler arasında bildirilen morfolojilerdeki farklılıkları açıkladığı33. Son olarak, pratik bir sonuç, Mag-Fluo-4 ile bir fiberin Ca2+ geçici akımını kaydederek, türünü güvenilir bir şekilde bilmenin mümkün olmasıdır.

Kaslarda ve izole liflerde MHC ekspresyonu: fizyolojik deneylerde kullanılan lif türleri için çıkarımlar
Lif türünü bilmek, kas araştırmalarının güvenilirliğini artırır. Örneğin, lif tiplerine göre diferansiyel olarak ifade edilen herhangi bir proteinin nakavt farelerinde, FDB'nin liflerinin herhangi bir tipleme yapılmadan kullanılması yanıltıcı sonuçlara yol açabilir. Verilerimiz, FDB'nin önceki makalelerle uyumlu olarak tip IIX liflerinin baskın olduğu karışık bir kas olduğunu doğrulamaktadır 25,31,56. Daha da önemlisi, tüm kasta bulunan lif tiplerinin oranı ile ayrışmadan sonra elde edilen lif tiplerinin oranı arasında yüksek bir uyum vardı. Bu bilgi yeni olduğundan ve genellikle FDB lifleri kullanan makalelerde tartışılmadığından, şans eseri, ayrışmış FDB liflerinde elde edilen birçok sonucun, tip I liflerden gelen ~%20-25 ve tip II'den gelen %75-80'lik karışık bilgileri gerçekten yansıtabileceği tahmin edilebilir. FDB kasını kullanan gelecekteki çalışmalar, lif tiplerine göre verileri ve bunlara karşılık gelen tartışmaları sunmalıdır.

Soleus, oksidatif tip I, IIA ve I/IIA lifleri57,58,59 açısından oldukça zengin olduğundan, bunlar ayrışmadan sonra süspansiyonda bulunan liflerdir33. Bir başka iyi bilinen kas olan EDL, neredeyse tip I liflerdenyoksundur 57,58,59, bu nedenle ayrışmadan sonra sadece hızlı lifler oluşturur 33. Aynı mantığı izleyerek ve farenin peronei kaslarında bulunan birkaç tip I lifin merkezi60 olduğu ve hafif bir ayrışma sırasında ulaşılmasının beklenmediği gerçeğiyle desteklenen üç yeni kasta tip II liflerin zenginleştiğini gösteren tipleme sonuçlarına göre, PDQA'nın ayrışmış lifleri ile yapılan bir deneyde hızlı bir IIX veya IIB lifi kullanma olasılığının, PL veya EHL %80-90 kadar yüksek olabilir. Bu, MT-I sinyallerinin bulunmadığı Ca2+ geçici verilerinin verilerine göre doğru gibi görünüyor. Boyutları göz önüne alındığında, bu lifler, işlevsel bir deneyi bitirdikten sonra yazmaya uygun olma avantajını sunar. Ayrıca, BTS'nin MHC II'ye özgülüğü, hareket artefaktlarını ortadan kaldırırken fiber türleri arasında ayrım yapmaya yardımcı olur. Son olarak, bu fiber tipleme yöntemi, yakın zamanda açıklanan optimize edilmişolanlardan daha zahmetli olsa da, 61,62, mevcut çalışmanın sonuçlarını etkilemedi.

Sonuç
Sunulan metodolojik ayrıntılar, kas biyolojisi çalışmasında enzimatik olarak ayrışmış çeşitli kas liflerinin kullanımını teşvik edebilir. Modelin çok yönlülüğü, çok çeşitli uzunluk ve tiplerde lifler elde etme olasılığı ve bunların çeşitli deneysel uygulamalarda kullanımı ile desteklenmektedir. Yıllar önce dissosiyasyonu bildirilen FDB, EDL ve soleusun yanı sıra, PDQA, PL ve EHL gibi diğer kaslardan orta ve uzun liflerin elde edilmesinin fizibilitesini gösterdik. Diseksiyonun gerçekleştirilme kolaylığı ve elde edilebilecek lif sayısının yanı sıra liflerin homojenliği ve büyüklüğü göz önüne alındığında, PL'yi olgun iskelet kası çalışmaları için rutin, uygun bir model olarak öneriyoruz. Bu, iskelet kasındakiCa2+ geçici akımlarının kinetiğinin, kaynaklarından bağımsız olarak genelleştirilebileceğine dair bulgularımızla desteklenmektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Acknowledgments

Yazarlar, UdeA'dan Profesör Robinson Ramírez'e hayvanlar ve bazı fotoğraflar konusundaki yardımları için ve teknik destek için Carolina Palacios'a şükranlarını sunarlar. Kaika'dan Johan Pineda, renkli ve floresan kameraları kurmamıza yardımcı oldu. Queensland Üniversitesi'nden Shyuan Ngo, el yazmasını nazikçe düzeltti. Bu çalışma CODI-UdeA (22 Şubat 2021'den itibaren 2020-34909 ve 31 Mart 2022'den itibaren 2021-40170, SIU) ve Planlama Ofisi-UdeA (E01708-K ve ES03180101), Medellín, Kolombiya tarafından JCC'ye finanse edilmiştir. Fon sağlayıcılar veri toplama ve analizine, makale yazımına veya gönderimine katılmamıştır.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Absolute ethanol Sigma Aldrich 32221
Acetone Merck 179124
Acrylamide Gibco BRL 15512-015
Ammonium persulfate Panreac 141138.1610
Anti myosin I antibody Sigma Aldrich M4276 Primary antibody
Anti myosin II antibody Sigma Aldrich M8421 Primary antibody
Anti myosin IIA antibody American Type Culture Collection SC-71 Primary antibody. Derived from HB-277 hybridoma
Anti myosin IIB antibody Developmental Studies Hybridoma Bank BF-F3-c  Primary antibody
Bis-acrylamide AMRESCO 0172
Bovine serum albumin Thermo Scientific B14
Bradford reagent Merck 1.10306.0500
Bromophenol blue Carlo Erba 428658
Calcium carbonate Merck 102066
Calcium dichloride (CaCl2) Merck 2389
Chloroform Sigma Aldrich 319988
Collagenase type 2 Worthington CLS-2/LS004176
Consul-Mount Thermo Scientific 9990440
Coomassie Brilliant blue R 250  Merck 112553
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich D2650
Dithiothreitol (DTT) AMRESCO 0281
Edetic acid (EDTA AMRESCO 0322
Eosin Y Sigma Aldrich E4009
Glycerol Panreac  1423291211
Glycine Panreac 151340.1067
Goat serum Sigma Aldrich G9023
Hematoxylin Thermo Scientific 6765015
HEPES AMRESCO 0511
Hoechst 33258 Sigma Aldrich 861405
Imidazole AMRESCO M136
Isopentane Sigma Aldrich M32631
Laminin Sigma Aldrich L2020
Mag-Fluo-4, AM Invitrogen M14206 Prepared only in DMSO. Pluronic acid is not required and should not be used to avoid fiber deterioration.
Mercaptoethanol Applichem A11080100
Methanol Protokimica MP10043
Mice Several Several For this manuscript, we only used C57BL/6 mice. However, some preliminary results have shown that the protocol works well for Swiss Webster mice of the same age and weight.
Mowiol 4-88 Sigma Aldrich 81381
N,N,N',N'-tetramethylethane-1,2-diamine (TEMED) Promega V3161
N-benzyl-p-toluene sulphonamide (BTS) Tocris 1870
Optimal cutting compound (OCT) Thermo Scientific 6769006
Secondary antibody Thermo Scientific A-11001 Goat anti-mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488
Sodium dodecil sulfate Panreac  1323631209
TRIS 0.5 M, pH 6.8  AMRESCO J832
Tris(Hydroxymethyl)aminomethane AMRESCO M151
Triton X-100 AMRESCO M143
Materials
Dissection chamber Custom-made
Charged slides Erie Scientific 5951PLUS
Experimental bath chamber Warner Instruments RC-27NE2 Narrow Bath Chamber with Field Stimulation, ensembled on a heated platform PH-6
Fine forceps World Precision Instruments 500338, 500230
Fine scissors World Precision Instruments Vannas Scissors 501778
Glass Pasteur pipettes Several Fire-polished tips
Glass vials with cap Several 2-3 mL volumen
Operating scissors World Precision Instruments 501223-G
Equipment
Centrifuge Thermo Scientific SL 8R
Confocal microscope Olympus FV1000
Cryostat Leica CM1850
Digital camera Zeiss Erc 5s and Axio 305 Axio 305, coupled to the Stemi 508 stereoscope, was used to take pictures during dissection; while Erc 5s or Axio 208, coupled to the Axio Observer A1 microscope, were used to take images of the isolated fibers and the immunofluorescence assays
Digitizer Molecular Devices 1550A Digidata
Electrophoresis chamber Bio Rad Mini-Protean IV
Inverted microscope coupled to fluorescence Zeiss Axio Observer A1 Coupled to an appropriate light source, filters and objectives for fluorescence
Photomultiplier Horiba R928 tube, Hamamatsu, in a D104 photometer, Horiba Coupled to the lateral port of the fluorescence microscope
Stereoscope Zeiss Stemi 508
Stimulator  Grass Instruments  S6
Water bath  Memmert WNE-22
Xilol Sigma Aldrich 808691
Software
Free software for electrophoreses analyses University of Kentucky GelBandFitter v1.7 http://www.gelbandfitter.org
Free software for image analysis and morphometry National Institutes of Health ImageJ v1.54 https://imagej.nih.gov/ij/index.html
Licensed software for Ca2+ signals acquisition and analyses Molecular Devices pCLAMP v10.05 https://www.moleculardevices.com
Licensed software for statistical analyses and graphing OriginLab OriginPro 2019 https://www.originlab.com/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: a brief review of structure and function. Calcif Tissue Int. 96 (3), 183-195 (2015).
  2. Barclay, C., Launikonis, B. Components of activation heat in skeletal muscle. J Muscle Res Cell Motil. 42 (1), 1-16 (2021).
  3. Gallo-Villegas, J. A., Calderón, J. C. Epidemiological, mechanistic, and practical bases for assessment of cardiorespiratory fitness and muscle status in adults in healthcare settings. Eur J Appl Physiol. 123 (5), 945-964 (2023).
  4. Cardamone, M., Darras, B. T., Ryan, M. M. Inherited myopathies and muscular dystrophies. Semin Neurol. 28 (2), 250-259 (2008).
  5. Sánchez-Aguilera, P., et al. Role of ABCA1 on membrane cholesterol content, insulin-dependent Akt phosphorylation and glucose uptake in adult skeletal muscle fibers from mice. Biochim Biophys Acta. 1863 (12), 1469-1477 (2018).
  6. Cruz-Jentoft, A. J., et al. Sarcopenia: revised European consensus on definition and diagnosis. Age Ageing. 48 (1), 16-31 (2019).
  7. Narvaez-Sanchez, R., Calderón, J. C., Vega, G., Trillos, M. C., Ospina, S. Skeletal muscle as a protagonist in the pregnancy metabolic syndrome. Med Hypotheses. 126, 26-37 (2019).
  8. Gallo-Villegas, J., et al. Efficacy of high-intensity interval- or continuous aerobic-training on insulin resistance and muscle function in adults with metabolic syndrome: a clinical trial. Eur J Appl Physiol. 122 (2), 331-344 (2022).
  9. Close, R. Properties of motor units in fast and slow skeletal muscles of the rat. J Physiol. 193 (1), 45-55 (1967).
  10. Barnard, R. J., Edgerton, V. R., Furukawa, T., Peter, J. B. Histochemical, biochemical, and contractile properties of red, white, and intermediate fibers. Am J Physiol. 220, 410-414 (1971).
  11. Bär, A., Pette, D. Three fast myosin heavy chains in adult rat skeletal muscle. FEBS letters. 235 (1-2), 153-155 (1988).
  12. Schiaffino, S., et al. Myosin heavy chain isoforms and velocity of shortening of type 2 skeletal muscle fibres. Acta Physiol Scand. 134 (4), 575-576 (1988).
  13. Schiaffino, S., et al. Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres. J Muscle Res Cell Motil. 10 (3), 197-205 (1989).
  14. Ranatunga, K., Thomas, P. Correlation between shortening velocity, force-velocity relation and histochemical fibre-type composition in rat muscles. J Muscle Res Cell Motil. 11 (3), 240-250 (1990).
  15. Hämäläinen, N., Pette, D. The histochemical profiles of fast fiber types IIB, IID, and IIA in skeletal muscles of mouse, rat, and rabbit. J Histochem Cytochem. 41 (5), 733-743 (1993).
  16. Agbulut, O., Li, Z., Mouly, V., Butler-Browne, G. S. Analysis of skeletal and cardiac muscle from desmin knock-out and normal mice by high resolution separation of myosin heavy-chain isoforms. Biol Cell. 88 (3), 131-135 (1996).
  17. Bekoff, A., Betz, W. Properties of isolated adult rat muscle fibres maintained in tissue culture. J Physiol. 271 (2), 537-547 (1977).
  18. Bekoff, A., Betz, W. Physiological properties of dissociated muscle fibres obtained from innervated and denervated adult rat muscle. J Physiol. 271 (1), 25-40 (1977).
  19. Schuetze, S. M. The acetylcholine channel open time in chick muscle is not decreased following innervation. J Physiol. 303, 111-124 (1980).
  20. Youhanna, S., Bruton, J., Jardemark, K., Westerblad, H., Lauschke, V. M. Calcium measurements in enzymatically dissociated or mechanically microdissected mouse primary skeletal muscle fibers. STAR Protoc. 4 (2), 102260 (2023).
  21. Wozniak, A. C., Anderson, J. E. Single-fiber isolation and maintenance of satellite cell quiescence. Biochem Cell Biol. 83 (5), 674-676 (2005).
  22. Anderson, J. E., Wozniak, A. C., Mizunoya, W. Single muscle-fiber isolation and culture for cellular, molecular, pharmacological, and evolutionary studies. Methods Mol Biol. 798, 85-102 (2012).
  23. Bolaños, P., Guillen, A., Gámez, A., Caputo, C. Quantifying SOCE fluorescence measurements in mammalian muscle fibres. The effects of ryanodine and osmotic shocks. J Muscle Res Cell Motil. 34 (5-6), 379-393 (2013).
  24. Lopez, R., et al. Raptor ablation in skeletal muscle decreases Cav1.1 expression and affects the function of the excitation-contraction coupling supramolecular complex. Biochem J. 466 (1), 123-135 (2015).
  25. Tarpey, M. D., et al. Characterization and utilization of the flexor digitorum brevis for assessing skeletal muscle function. Skelet Muscle. 8 (1), 14 (2018).
  26. Milán, A. F., et al. Calibration of mammalian skeletal muscle Ca2+ transients recorded with the fast Ca2+ dye Mag-Fluo-4. Biochim Biophys Acta. 1865 (9), 129939 (2021).
  27. Park, K. H., et al. Assessment of calcium sparks in intact skeletal muscle fibers. J Vis Exp. (84), e50898 (2014).
  28. Wei-LaPierre, L., Groom, L., Dirksen, R. T. Acute exposure to extracellular BTP2 does not inhibit Ca2+ release during EC coupling in intact skeletal muscle fibers. J Gen Physiol. 154 (9), 202112976 (2022).
  29. Banks, Q., et al. Voltage sensor movements of Ca(V)1.1 during an action potential in skeletal muscle fibers. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (40), 2026116118 (2021).
  30. Jaque-Fernandez, F., et al. Preserved Ca2+ handling and excitation-contraction coupling in muscle fibres from diet-induced obese mice. Diabetologia. 63 (11), 2471-2481 (2020).
  31. Ravenscroft, G., et al. Dissociated flexor digitorum brevis myofiber culture system--a more mature muscle culture system. Cell Motil Cytoskeleton. 64 (10), 727-738 (2007).
  32. Leduc-Gaudet, J. -P., et al. MYTHO is a novel regulator of skeletal muscle autophagy and integrity. Nat Commun. 14 (1), 1199 (2023).
  33. Calderón, J. C., Bolaños, P., Caputo, C. Myosin heavy chain isoform composition and Ca2+ transients in fibres from enzymatically dissociated murine soleus and extensor digitorum longus muscles. J Physiol. 588 (1), 267-279 (2010).
  34. Calderón, J. C., Bolaños, P., Caputo, C. Kinetic changes in tetanic Ca2+ transients in enzymatically dissociated muscle fibres under repetitive stimulation. J Physiol. 589 (21), 5269-5283 (2011).
  35. Calderón, J. C., Bolaños, P., Caputo, C. Tetanic Ca2+ transient differences between slow- and fast-twitch mouse skeletal muscle fibres: a comprehensive experimental approach. J Muscle Res Cell Motil. 35 (5-6), 279-293 (2014).
  36. Li, R., et al. Development of a high-throughput method for real-time assessment of cellular metabolism in intact long skeletal muscle fibre bundles. J Physiol. 594 (24), 7197-7213 (2016).
  37. Chemello, F., et al. Microgenomic analysis in skeletal muscle: expression signatures of individual fast and slow myofibers. PloS One. 6 (2), 16807 (2011).
  38. Williams, D. A., Head, S. I., Bakker, A. J., Stephenson, D. G. Resting calcium concentrations in isolated skeletal muscle fibres of dystrophic mice. J Physiol. 428 (1), 243-256 (1990).
  39. Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle. J Vis Exp. (73), e50074 (2013).
  40. Brun, C. E., et al. GLI3 regulates muscle stem cell entry into G(Alert) and self-renewal. Nat Commun. 13 (1), 3961 (2022).
  41. Percie du Sert, N., et al. The ARRIVE guidelines 2.0: updated guidelines for reporting animal research. J Physiol. 598 (18), 3793-3801 (2020).
  42. Charles, J. P., Cappellari, O., Spence, A. J., Hutchinson, J. R., Wells, D. J. Musculoskeletal geometry, muscle architecture and functional specialisations of the mouse hindlimb. PLoS One. 11 (4), 0147669 (2016).
  43. Enríquez, V., Granados, S., Arias, M. P., Calderón, J. C. Muscle fiber types of gluteus medius in the Colombian creole horse. J Equine Vet Sci. 35 (6), 524-530 (2015).
  44. Sartorius, C. A., et al. Myosin heavy chains IIa and IId are functionally distinct in the mouse. J Cell Biol. 141 (4), 943-953 (1998).
  45. Talmadge, R. J., Roy, R. R. Electrophoretic separation of rat skeletal muscle myosin heavy-chain isoforms. J Appl Physiol. 75 (5), 2337-2340 (1993).
  46. Hämäläinen, N., Pette, D. Patterns of myosin isoforms in mammalian skeletal muscle fibres. Microsc Res Tech. 30 (5), 381-389 (1995).
  47. Bolaños, P., Calderón, J. C. Excitation-contraction coupling in mammalian skeletal muscle: Blending old and last-decade research. Front Physiol. 13, 989796 (2022).
  48. Gineste, C., et al. Enzymatically dissociated muscle fibers display rapid dedifferentiation and impaired mitochondrial calcium control. iScience. 25 (12), 105654 (2022).
  49. Calderón, J. C., Bolaños, P., Caputo, C. The excitation-contraction coupling mechanism in skeletal muscle. Biophys Rev. 6 (1), 133-160 (2014).
  50. Lainé, J., Skoglund, G., Fournier, E., Tabti, N. Development of the excitation-contraction coupling machinery and its relation to myofibrillogenesis in human iPSC-derived skeletal myocytes. Skelet Muscle. 8 (1), (2018).
  51. Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue. Nat Commun. 9 (1), 126 (2018).
  52. Cea, L. A., et al. The absence of dysferlin induces the expression of functional connexin-based hemichannels in human myotubes. BMC Cell Biology. 17 (15), 127-136 (2016).
  53. Nakada, T., et al. Physical interaction of junctophilin and the Ca(V)1.1 C terminus is crucial for skeletal muscle contraction. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (17), 4507-4512 (2018).
  54. Cully, T. R., Edwards, J. N., Murphy, R. M., Launikonis, B. S. A quantitative description of tubular system Ca2+ handling in fast- and slow-twitch muscle fibres. J Physiol. 594 (11), 2795-2810 (2016).
  55. Lim, J. -Y., Frontera, W. R. Single skeletal muscle fiber mechanical properties: a muscle quality biomarker of human aging. Eur J Appl Physiol. 122 (6), 1383-1395 (2022).
  56. Gonzalez, E., Messi, M. L., Zheng, Z., Delbono, O. Insulin-like growth factor-1 prevents age-related decrease in specific force and intracellular Ca2+ in single intact muscle fibres from transgenic mice. J Physiol. 552, 833-844 (2003).
  57. Luedeke, J. D., McCall, R. D., Dillaman, R. M., Kinsey, S. T. Properties of slow- and fast-twitch skeletal muscle from mice with an inherited capacity for hypoxic exercise. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 138 (3), 373-382 (2004).
  58. Asmussen, G., Schmalbruch, I., Soukup, T., Pette, D. Contractile properties, fiber types, and myosin isoforms in fast and slow muscles of hyperactive Japanese waltzing mice. Exp Neurol. 184 (2), 758-766 (2003).
  59. Augusto, V., Padovani, C. R., Campos, G. E. R. Skeletal muscle fiber types in C57BL6J mice. Braz J Morphol Sci. 21 (2), 89-94 (2004).
  60. Wang, L. C., Kernell, D. Fibre type regionalisation in lower hindlimb muscles of rabbit, rat and mouse: a comparative study. J Anat. 199, 631-643 (2001).
  61. Abbassi-Daloii, T., et al. Quantitative analysis of myofiber type composition in human and mouse skeletal muscles. STAR Protoc. 4 (1), 102075 (2023).
  62. Tulloch, L. K., Perkins, J. D., Piercy, R. J. Multiple immunofluorescence labelling enables simultaneous identification of all mature fibre types in a single equine skeletal muscle cryosection. Equine Vet J. 43 (4), 500-503 (2011).

Tags

Biyoloji Sayı 202 iskelet kası kas lifleri lif tipleri Ca2+ uyarma-kasılma eşleşmesi immünofloresan miyozin ağır zinciri
Farelerin Altı Arka Bacak Kasının Enzimatik Ayrışmasıyla Elde Edilen Sağlam Kısa, Orta ve Uzun İskelet Kası Lifleri: Fleksör Digitorum Brevis'in Ötesinde
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Petro, J. L., Milán, A. F.,… More

Petro, J. L., Milán, A. F., Arenas, E., Valle, L., Hernández, V., Calderón, J. C. Intact Short, Intermediate, and Long Skeletal Muscle Fibers Obtained by Enzymatic Dissociation of Six Hindlimb Muscles of Mice: Beyond Flexor Digitorum Brevis. J. Vis. Exp. (202), e65851, doi:10.3791/65851 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter